慢病毒介導(dǎo)的肺特異性X蛋白(LUNX)siRNA轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)A549肺癌株抑制作用的研究.pdf

1、作為一名肺腫瘤外科醫(yī)生，必須掌握生物腫瘤標(biāo)志物和分子、基因組學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)，這樣才能把握肺癌研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展。肺癌的分子生物學(xué)特征呈現(xiàn)出高度的復(fù)雜性和變化的異質(zhì)性，在生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因?qū)W、蛋白基因組學(xué)等多個(gè)學(xué)科層面上的分子機(jī)制和功能變化還尚未明確，外科醫(yī)生在這些方面的深入理解，非常有助于進(jìn)一步研究肺癌的診斷方法、治療手段和預(yù)后檢測(cè)。
　　肺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多時(shí)間點(diǎn)、多變化性的進(jìn)展過程，可以認(rèn)為肺癌仍然是一種由諸多個(gè)性化基因或者

2、基因組驅(qū)動(dòng)的疾病，并非單一基因突變能夠?qū)е?，其中包括多種多樣的基因功能異常。大多數(shù)學(xué)者已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，促癌基因和抑癌基因的改變共同貫穿了肺癌的整個(gè)進(jìn)展過程，特別是促癌基因相關(guān)通路的激活和抑癌基因相關(guān)通路的失活。對(duì)這些信號(hào)通路的研究，包括肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的研究，對(duì)于治療策略的進(jìn)展至關(guān)重要。使用這些信息來指導(dǎo)治療的基礎(chǔ)是治療基因的特異性改變。例如靶向基因調(diào)控異常的分子信號(hào)及其激活的下游通路。近年來，依據(jù)新型靶向藥物以及新的腫瘤生物標(biāo)記物

3、來指導(dǎo)臨床治療，促使腫瘤生長的特定基因改變及其提供的治療靶點(diǎn)在肺癌的治療中已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的臨床效果，仍然需要進(jìn)一步探索新的治療靶點(diǎn)及其相應(yīng)藥物。
　　肺癌是全世界范圍內(nèi)患病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，每年總計(jì)約有七百萬人死于肺癌及肺癌相關(guān)并發(fā)癥。隨著工業(yè)化污染和大氣污染的加劇，肺癌已經(jīng)成為中國居民中患病率和病死率上升最快的惡性腫瘤，已經(jīng)占據(jù)男性腫瘤患者死亡原因的第一位，女性腫瘤患者死亡原因的第二位，每年病死人數(shù)在六十萬以上，肺癌

4、總體病死人數(shù)占到了總體腫瘤死亡人數(shù)的22.7％。
　　從肺外科醫(yī)生的角度來看，手術(shù)治療是治療肺癌的最佳治療手段，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的肺小結(jié)節(jié)病灶被發(fā)現(xiàn)，肺段切除術(shù)、亞肺葉切除術(shù)、肺葉切除術(shù)治療肺結(jié)節(jié)開展的越來越廣泛，術(shù)后病理證實(shí)，其中大部分結(jié)節(jié)為惡性，而且早期非小細(xì)胞肺癌占大多數(shù)。但是中國大多數(shù)肺癌患者初次就診已經(jīng)進(jìn)入中晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)，即使是沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IA、IB期患者，在接受根治性切除手術(shù)后5年內(nèi)，復(fù)發(fā)率仍

5、然高達(dá)30％以上。研究表明，肺癌患者大部分存在隱匿性微轉(zhuǎn)移病灶，只是現(xiàn)有的彩超、CT、MRI，甚至PET-CT等常規(guī)臨床檢查手段無法早期發(fā)現(xiàn)。
　　肺癌的診療模式已經(jīng)進(jìn)入多學(xué)科協(xié)作(MDT)模式和精準(zhǔn)治療時(shí)代，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療、療效預(yù)測(cè)、改善預(yù)后，是新時(shí)代肺癌治療領(lǐng)域的最主流方向。目前肺癌的早期微轉(zhuǎn)移檢查方法集中在血液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方向，但是尚有許多不足之處，同時(shí)，液體活檢技術(shù)快速發(fā)展，包括血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血漿游離D

6、NA和外泌體的檢測(cè)，這是蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)進(jìn)展的臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化，也是肺癌進(jìn)入基因治療時(shí)代的必然趨勢(shì)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體越來越引起重視，這種物質(zhì)包含是一種包含腫瘤基因miRNA及其蛋白產(chǎn)物，通過與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞相互作用，在腫瘤進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等方面有重要意義。
　　日本腫瘤科醫(yī)生Kyoko Iwao Koizumi通過蛋白差異顯示技術(shù)，分離出一種在人類呼吸系統(tǒng)臟器內(nèi)特有表達(dá)的蛋白一肺特異性X蛋白mRNA(LUNX

7、mRNA)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LUNX mRNA在肺癌組織、癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、前哨淋巴結(jié)、跳躍性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、肺癌轉(zhuǎn)移灶中均存在高表達(dá)，因此，證明LUNX mRNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中有重要作用，LUNX mRNA檢測(cè)是一種早期發(fā)現(xiàn)肺癌亞臨床微轉(zhuǎn)移的有效手段，LUNX mRNA也是肺癌臨床基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
　　Small interfering RNA(siRNA):是一種小RNA分子（21-25核苷酸），長度約在22n

8、t左右，由Dicer（RNAaseⅢ家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。SiRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。siRNA通過干擾細(xì)胞內(nèi)正在轉(zhuǎn)錄的mRNA，從而抑制個(gè)別基因的表達(dá)，進(jìn)一步阻止其蛋白合成。Dicer酶將一個(gè)由能自我復(fù)制的基因序列，又稱miRNA的調(diào)控序列生成的長片段，切割成短siRNA。siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的途徑是轉(zhuǎn)

9、染表達(dá)，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并與mRNA產(chǎn)生完全互補(bǔ)作用。siRNA的功能是導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，是RNA干擾作用的產(chǎn)物，siRNA的原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性，在某些病毒感染人體時(shí)，能抑制病毒感染，是人體自我保護(hù)機(jī)制。然而，siRNA的設(shè)計(jì)需要仔細(xì)比對(duì)靶基因的生物信息學(xué)分析。靶標(biāo)一般在CDS區(qū)選擇:siRNA的作用是在mRNA水平，而不是在蛋白質(zhì)水平。設(shè)計(jì)siRNA之前，需要進(jìn)行Gene Bank庫準(zhǔn)確檢索靶mRNA的序

10、列。某些情況下，會(huì)出現(xiàn)siRNA的無效設(shè)計(jì)，所以不是根據(jù)基因組序列，而是根據(jù)mRNA序列而來設(shè)計(jì)。
　　RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNA i)是通過小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)造成目的mRNA特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。RNA干擾由轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活。沉默機(jī)制可導(dǎo)致由小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA(shRNA)誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶m

11、RNA的降解，或者通過小RNA(miRNA)誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制。通過幾種蛋白的活性，通過短反義核酸（siRNA和shRNA序列）鎖定細(xì)胞mRNA，從而實(shí)現(xiàn)其隨后的降解。這反過來阻斷了該蛋白的進(jìn)一步表達(dá)/聚集，導(dǎo)致其水平的下降，最終實(shí)現(xiàn)抑制作用。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界生命體中，是一種在生物進(jìn)化過程中，能夠有效抵御外來基因改變?cè)谢蚪Y(jié)構(gòu)作用的機(jī)制，為保持生物基因組穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。RNA i可以作為一種高效的基因剔除工具，廣泛

12、應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域，并將逐漸進(jìn)入肺癌臨床基因治療時(shí)代。
　　慢病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，作為一種載體，慢病毒表達(dá)質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)、整合目標(biāo)基因mRNA至受體染色體組DNA，并進(jìn)一步達(dá)到持久性表達(dá)，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)安全、高效，可以達(dá)到良好的基因干擾與基因沉默效果。本次試驗(yàn)研究，通過慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，以LUNX蛋白表達(dá)陽性的A549肺癌細(xì)胞（腺癌）株為研究對(duì)象，以LUNX mRNA為目的靶基因，轉(zhuǎn)染表達(dá)LUNX

13、siRNA進(jìn)入肺癌細(xì)胞，并通過免疫組織化學(xué)法、Real-time PCR(RT-PCR)技術(shù)、噻唑藍(lán)(MTT)比色法、免疫酶化學(xué)法、劃痕實(shí)驗(yàn)法、透射電鏡觀察等技術(shù)，研究LUNX mRNA的降低表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外通過檢測(cè)A549肺癌細(xì)胞株的堿性磷酸酶(AKP)、表面活性蛋白(SPC)和溴化脫氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)的表達(dá)變化，進(jìn)一步分析LUNX mRNA調(diào)控A549肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的信號(hào)通路和分子機(jī)制。本研究旨在通過以

14、上實(shí)驗(yàn)探討LUNXmRNA在肺癌早期微轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)理，篩選LUNX作為新的肺癌治療靶點(diǎn)，檢驗(yàn)其作為靶向基因治療的可能性、為肺癌的精準(zhǔn)治療研究、新型基因治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供必要的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。
　　目的:
　　1.1 根據(jù)LUNX編碼區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)并合成LUNX siRNA的DNA，以慢病毒(pGCL和pHelper1.0)為載體，構(gòu)建并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　1.2 研究LUNX轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)A549肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)、

15、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能的影響。
　　方法:
　　2.1 應(yīng)用慢病毒基因轉(zhuǎn)染表達(dá)方法檢測(cè)LUNX表達(dá)對(duì)A549肺癌細(xì)胞株的抗增殖作用和生物學(xué)功能的影響。
　　2.2 MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察A549肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力變化。
　　2.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)A549肺癌細(xì)胞株中LUNX-siRNA的表達(dá)。
　　2.4 通過免疫組織化學(xué)法和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LUNX-siRNA在A549肺癌細(xì)胞株

16、中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　3.1 利用LUNX基因確定其序列特異性，設(shè)計(jì)并合成LUNX-siRNA的DNA，退火、酶切、連接載體后進(jìn)入pGCL-GFP表達(dá)質(zhì)粒?；旌蟨Helper1.0和pGCL-GFP載體，成功構(gòu)建LUNX-siRNA慢病毒載體。
　　3.2 將體外培養(yǎng)好的A549肺癌細(xì)胞株分為3組:A組:LUNX-siRNA和pGCL-GFP共轉(zhuǎn)染組，B組:未轉(zhuǎn)染組，C組:pGCL和pHelper1.0共轉(zhuǎn)染

17、組，A組為實(shí)驗(yàn)組，B，C兩組為對(duì)照組。成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)染后，加入400μgPmIG419篩選，經(jīng)3周后形成陽性克隆組，擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　3.3 LUNX轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞株遷移能力低于正常A549細(xì)胞株(P=0.026)。
　　3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)轉(zhuǎn)染后A549肺癌細(xì)胞中有LUNX穩(wěn)定表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　4.1 成功構(gòu)建帶有靶向基因特異性小干擾RNA的慢病毒，將其感染肺癌細(xì)胞后，可有效降低目標(biāo)蛋白-肺特異性Ⅹ蛋