特異性siRNA治療CCI大鼠神經(jīng)痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、N-型鈣通道是治療慢性神經(jīng)痛的一個(gè)重要藥理學(xué)靶點(diǎn)，目前臨床上應(yīng)用的N型鈣通道阻斷劑不僅影響傷害性感受傳導(dǎo)通路的功能，也影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)及自主神經(jīng)系統(tǒng)的功能。有研究發(fā)現(xiàn)N-型鈣通道CaV2.2e37a亞型特異地表達(dá)于背根節(jié)神經(jīng)元，本課題組在前期的研究中已經(jīng)設(shè)計(jì)篩選出針對CaV2.2e37a有特異性抑制作用的siRNA，并在293FT細(xì)胞上驗(yàn)證了該siRNA可以特異性的抑制與其共轉(zhuǎn)染CaV2.2e37a全長基因的表達(dá)。本研究擬用慢病毒載體攜

2、帶該siRNA治療CCI大鼠神經(jīng)痛，觀察其鎮(zhèn)痛效果及毒副作用，為進(jìn)一步研發(fā)以CaV2.2e37a為靶點(diǎn)的鎮(zhèn)痛藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 針對CaV2.2e37a基因的SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的：構(gòu)建針對CaV2.2e37a基因的SiRNA慢病毒載體，為研究抑制CaV2.2e37a基因表達(dá)治療神經(jīng)痛打下基礎(chǔ)。方法：針對已經(jīng)篩選確定的有效沉默CaV2.2e37a基因的siRNA序列，合成該序列的Ol

3、igoDNA，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后的pLL3.7載體連接，構(gòu)建pLL3.7-CaV2.2e37a干擾質(zhì)粒，挑取重組陽性克隆行測序鑒定。pLL3.7含有能持續(xù)表達(dá)小RNA的元件，同時(shí)能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），將pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、pLL3.7-CaV2.2e37a共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光定量PCR測定病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度。結(jié)果：測序結(jié)果表明合成的siRNA核苷酸序列正確插入到

4、慢病毒載體中，說明干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。濃縮病毒懸液的滴度為1×109Tu/ml。結(jié)論：成功構(gòu)建了針對Car2.2e37a基因干擾序列的慢病毒載體LV-shCaV2.2e37a。
　　 第二部分 CCI大鼠模型的建立及其背根神經(jīng)節(jié)中CaV2.2表達(dá)的變化
　　 目的：建立大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓迫模型，檢測CCI大鼠DRG中CaV2.2表達(dá)的變化。方法：大鼠CCI模型的建立及行為學(xué)測定：健康雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組（n=1

5、0），CCI組：切開大鼠右側(cè)大腿皮膚，鈍性分離肌肉，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，4-0鉻制腸線圍繞坐骨神經(jīng)干均勻打4個(gè)間隔1mm的線結(jié)，左側(cè)不予處理；對照組：暴露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，不進(jìn)行處理，分層縫合切口，左側(cè)不予處理。在手術(shù)后第3d，7d，10d，15d，20d，30d，40d時(shí)觀察感覺異常和痛覺過敏閾值的變化，以觸誘發(fā)痛閾值和熱痛覺過敏閾值出現(xiàn)明顯且穩(wěn)定的下降為模型建立成功的標(biāo)志。行為學(xué)觀察結(jié)束后，冰上處死大鼠取L4-6DRG，Real-ti

6、me PCR及Western blotting檢測其CaV2.2轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：CCI組較對照組手術(shù)后第3天即有MWT的下降（P<0.01），至術(shù)后第7天MWT及TWT達(dá)到高峰（P<0.01），之后在觀察期內(nèi)基本保持穩(wěn)定。CCI組CaV2.2mRNA及蛋白水平較對照組表達(dá)明顯增加（P<0.01）。結(jié)論：利用鉻制腸線成功制備SD大鼠CCI模型，用于神經(jīng)病理性疼痛的研究；CCI大鼠DRG中caV2.2 mRNA及蛋白水平表達(dá)

7、上調(diào)，提示CaV2.2與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　 第三部 分鞘內(nèi)注射LV-shCaV2.2e37a對CCI大鼠痛閾的影響及其對大鼠毒副作用的觀察
　　 目的：研究鞘內(nèi)注射LV-shCaV2.2e37a對CCI模型大鼠痛閾的影響，并觀察其注射后的長期毒副作用。方法：健康雄性SD大鼠64只，隨機(jī)分為5組，siRNA治療組及陽性對照組14只，CCI組、陰性對照組及正常組各12只。siRNA治療組于制作CCI模型第7

8、天，大鼠出現(xiàn)明顯的痛閾降低后，鞘內(nèi)注射LV-shCaV2.2e37a10μl（1×109TU/mL）；陽性對照組于制作CCI模型后1天鞘內(nèi)置管，置管成功的大鼠于造模后第7天開始通過導(dǎo)管鞘內(nèi)注射齊考諾肽（600ng/d）；陰性對照組于制作CCI模型后第7天鞘內(nèi)注射空慢病毒顆粒10μl（1×109TU/mL）；CCI組為CCI大鼠，不進(jìn)行其它處理；正常組為正常大鼠。在鞘內(nèi)注射后的3d，1w，2w，3w，4w，6w時(shí)分別觀察大鼠的機(jī)械性縮足反

9、射閾值（MWT）和CO2激光熱縮足反射閾值（TWT）.于鞘內(nèi)注射后1w，隨機(jī)取2只siRNA治療組大鼠處死取L4-6DRG，共聚焦顯微鏡觀察DRG中GFP的表達(dá)，從而反映慢病毒載體在DRG組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況。大鼠于第6w行為學(xué)測定結(jié)束后處死，取心、肝、肺、腎、脊髓、脾，HE染色，常規(guī)病理觀察LV-shCaV2.2e37a的毒副作用。結(jié)果：鞘內(nèi)注射后3d，陽性對照組機(jī)械性縮足反射閾值（MWT）和CO2激光熱縮足反射閾值（TWT）較同一時(shí)

10、間點(diǎn)CCI組、SiRNA治療組及陰性對照組顯著增高（P<0.01），較正常組無明顯區(qū)別。鞘內(nèi)注射后1w，SiRNA治療組大鼠MWT及TWT較同一時(shí)間點(diǎn)CCI組及陰性對照組明顯提高（P<0.01），但仍低于陽性對照組及正常組（P<0.01）。鞘內(nèi)注射后2w，siRNA治療組大鼠MWT及TWT較同一時(shí)間點(diǎn)正常組及陽性對照組無顯著差異（P>0.05），較CCI組及陰性對照組明顯增高（P<0.01）。鞘內(nèi)注射1w時(shí)病毒治療大鼠DRG冰凍切片共聚