15744.sirna化學(xué)修飾位點特異性的機理研究

1、題目：題目：siRNA化學(xué)化學(xué)修飾位點特異性的機理研究修飾位點特異性的機理研究姓名：名：鄭潔學(xué)號：號：1001111296院系：系：分子醫(yī)學(xué)研究所分子醫(yī)學(xué)研究所導(dǎo)師：師：梁子才教授梁子才教授杜權(quán)副研究員杜權(quán)副研究員曹慧青副研究員曹慧青副研究員研究方向：研究方向：小核酸干擾技術(shù)研究小核酸干擾技術(shù)研究專業(yè)：業(yè)：生物學(xué)（生物技術(shù)）生物學(xué)（生物技術(shù)）二零一三年三年五月博士研究生學(xué)位論文博士研究生學(xué)位論文北京大學(xué)博士研究生學(xué)位論文siRNA化學(xué)修

2、飾位點特異性的機理研究i摘要siRNA由于其自身特有的沉默基因的作用而被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和藥物開發(fā)中。在臨床運用中，人們必須對siRNA進行化學(xué)修飾以克服天然siRNA本身在血清穩(wěn)定性以及脫靶效應(yīng)等方面的局限性。但化學(xué)修飾也是把雙刃劍，雖然修飾后的siRNA在血清穩(wěn)定性等方面得到了顯著提高，但卻往往會降低沉默基因的活性。如何合理地修飾才能使siRNA在提高血清穩(wěn)定性的同時又不喪失活性是這個領(lǐng)域的一個挑戰(zhàn)，而這個問題的本質(zhì)是缺乏對s

3、iRNA化學(xué)修飾與活性兩者間關(guān)系的機理的闡釋。雖然之前有不少科研人員做過這方面的嘗試，但是都沒有得到系統(tǒng)的、完善的解決方法?；谶@個問題對siRNA制藥領(lǐng)域的重要性，我們針對siRNA化學(xué)修飾位點與活性兩者間的關(guān)系進行了系統(tǒng)的研究和分析。為了探究siRNA的化學(xué)修飾所在位點與活性的關(guān)系，本研究對兩條siRNA的反義鏈219位的核苷酸依次進行單核苷2’OMe修飾并檢測各自的活性。發(fā)現(xiàn)siRNA的反義鏈的不同位點對于2’OMe修飾的容忍性各

4、不相同，這暗示著siRNA中存在著化學(xué)修飾位點特異性的現(xiàn)象。而且我們發(fā)現(xiàn)14位點對2’OMe修飾的容忍性最差，而該位點在之前文獻中并沒有研究過。為了進一步地證實這個位點的普遍性，我們又針對反義鏈的第1316四個位點進行了19條siRNA的修飾與檢測。每個位置的四種可能堿基都有三條對應(yīng)的siRNA作測試。在排除了堿基與序列等影響因素后，我們證實14位點的現(xiàn)象是普遍存在于siRNA中的。此外，我們還進行了雙核苷的搭配修飾，證明對于2’糖環(huán)修

5、飾而言，多點修飾后的siRNA的活性本質(zhì)上是由對應(yīng)的單個位點修飾的活性結(jié)果累加而成的。為了探討14位點修飾特異性現(xiàn)象的發(fā)生機制，我們首先排除了可能的Tm值的因素，然后又檢測了AGO2蛋白裝載的反義鏈的量的變化情況，發(fā)現(xiàn)相比天然反義鏈，14位點修飾后的反義鏈裝載進入AGO2蛋白的數(shù)量出現(xiàn)了顯著的下降，而這與siRNA活性是呈正相關(guān)的。因此，我確定反義鏈裝載量的減少是修飾后的反義鏈活性降低的重要因素。而進一步的濃度稀釋轉(zhuǎn)染結(jié)果說明，反義鏈裝