不同修飾模式的肝素寡糖的化學(xué)酶法合成及肝素酶的底物特異性研究.pdf

1、肝素和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)是由氨基葡萄糖(GlcN)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)以1→4糖苷鍵連接而成的二糖單元組成的糖胺聚糖，二糖單元的多個(gè)位置可以被硫酸化修飾，因此結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。肝素/HS中豐富的寡糖序列是其表現(xiàn)出多種多樣的生物活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。針對(duì)天然肝素的動(dòng)物源性和結(jié)構(gòu)不均一性造成的安全隱患，合成結(jié)構(gòu)確定的肝素/HS寡糖受到越來越多重視。單純化學(xué)法合成盡管進(jìn)展迅速，但仍面臨合成步

2、驟多、產(chǎn)率低等挑戰(zhàn)。最近發(fā)展的化學(xué)酶法策略因具有立體選擇性強(qiáng)、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，有望發(fā)展成為一種理想的肝素和HS寡糖的合成新技術(shù)。因此，本課題擬利用化學(xué)酶法合成具有不同硫酸化模式的肝素寡糖。此外，細(xì)菌來源的肝素酶(heparinases或heparin lyases)能夠通過β-消除機(jī)制降解肝素及HS，是表征其結(jié)構(gòu)和制備低分子量寡糖的重要工具酶。但是，之前的研究多以肝素及其衍生物為底物探究其催化機(jī)制和切割活性，結(jié)構(gòu)不均一的多糖底物很可能對(duì)酶

3、解活性產(chǎn)生干擾，極大增大了產(chǎn)物分析的難度，更難以清晰闡明肝素酶作用于不同切割位點(diǎn)時(shí)的差異。因此，本課題根據(jù)肝素酶可能的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成一系列結(jié)構(gòu)均一確定的HS寡糖作為底物，并深入探究三種肝素酶的底物適應(yīng)性，為拓展肝素酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　本學(xué)位論文取得的成果及結(jié)論包括以下幾個(gè)方面:
　　1.糖基供體和硫酸基供體的規(guī)?；苽?br>　　利用N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-三氟乙酰氨基葡萄糖(GlcNTFA)、ATP

4、、UTP為原料，在三種重組酶NahK、GlmU、PPA的共同催化作用下合成尿菅二磷酸(UDP)-GlcNTFA/UDP-GlcNAc;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)為原料，由UDP-Glc脫氫酶、乳酸脫氫酶(LDH)催化合成UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)。經(jīng)強(qiáng)離子交換柱層析純化后，糖基供體的純度可達(dá)98％以上，制備規(guī)?？蛇_(dá)克級(jí)。以Na2SO4、 ATP為原料，利用ATP硫酸化酶、APS激酶催化合成硫酸基供體PAPS，純化后

5、的產(chǎn)物純度達(dá)99％，制備規(guī)模達(dá)到克級(jí)。
　　2.肝素六糖的合成、純化及結(jié)構(gòu)表征
　　以對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷(GlcA-PNP)為起始原料，利用糖基轉(zhuǎn)移酶KfiA或PmHS2的催化，在其非還原端交替添加GlcNTFA(GlcNAc)或GlcA得到HS六糖骨架，每步反應(yīng)產(chǎn)率高達(dá)98％，經(jīng)反相C18柱層析純化，得到純度高于90％的六糖骨架，合成規(guī)模達(dá)百毫克級(jí)。利用LiOH脫除三氟乙酰基后，以PAPS為硫酸基供體，由N-硫

6、酸基轉(zhuǎn)移酶(NST)催化合成N-硫酸化六糖。然后在C5異構(gòu)化酶和2-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶（2-OST）的共同催化下，使糖鏈中介于兩個(gè)N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的GlcA殘基轉(zhuǎn)變?yōu)?-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)。最后由6-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶1/3(6-OST1/3)催化使寡糖的GlcNS或GlcNAc發(fā)生6-O-硫酸化修飾（GlcNS6S或GlcNAc6S）。三種硫酸化修飾模式的肝素寡糖產(chǎn)率分別為99％、72％、99％，經(jīng)離子交換柱層析

7、純化后的寡糖純度均高達(dá)99％，合成規(guī)模達(dá)到百毫克級(jí)。ESI-MS及NMR分析表明不同修飾模式的肝素六糖產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)均正確。
　　3.肝素酶的底物特異性研究
　　根據(jù)肝素酶可能的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)、并利用化學(xué)酶法合成了一系列結(jié)構(gòu)確定的肝素及HS寡糖，HPLC分析其純度＞90％，ESI-MS測(cè)定表明結(jié)構(gòu)的正確性。以合成的寡糖為底物，利用HPLC分析測(cè)定肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在不同條件下對(duì)它們的切割作用，以探究酶對(duì)不同底物的催化特異性。同時(shí)利用

8、表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)初步研究了肝素酶Ⅲ與不同HS寡糖底物的相互作用。研究結(jié)果表明:(1)肝素酶Ⅰ不能切割GlcN與非硫酸化糖醛酸之間的糖苷鍵位點(diǎn)（GlcN-GlcA或GlcN-IdoA），僅能切割-GlcNS-IdoA2S-，-GlcNS6S3S-IdoA2S-、-GlcNS-GlcA2S-之間的糖苷鍵，這一結(jié)果表明2-O-硫酸化糖醛酸(UA2S)是肝素酶Ⅰ切割必需的，而Glc

9、N的6-O-或3-O-硫酸化修飾對(duì)切割作用影響不大。(2)肝素酶Ⅲ可以切割含主要切割位點(diǎn)（GlcNAc-GlcA或 GlcN S-GlcA)的三糖底物（Tri-NAc或Tri-NS），但對(duì)Tri-NAc的催化效率顯著高于Tri-NS。肝素酶Ⅲ能夠耐受含不同修飾的GlcN(GlcNH2、GlcNAc6S及GlcNS6S)與GlcA之間的次要切割糖苷鍵，但催化效率顯著低于對(duì)應(yīng)的主要三糖底物，提示N-非取代或6-O-硫酸化修飾均會(huì)降低肝素酶Ⅲ

10、對(duì)HS寡糖底物的反應(yīng)活性。肝素酶Ⅲ對(duì)含IdoA的次要切割位點(diǎn)(GlcNS-IdoA)的反應(yīng)效率在反應(yīng)初期低于主要位點(diǎn)GlcNS-GlcA，但總體差別不大。HS寡糖中的IdoA2S大大降低肝素酶Ⅲ對(duì)其還原端相鄰的GlcNS-GlcA位點(diǎn)的切割效率，但是對(duì)其非還原端的位點(diǎn)的影響不大。肝素酶Ⅲ對(duì)底物的特異性強(qiáng)弱與底物分子大小有關(guān)的，即其對(duì)分子量越大的底物切割效率越高。肝素酶Ⅲ對(duì)含有多個(gè)位點(diǎn)的HS寡糖中的切割次序?yàn)殡S機(jī)切割，這與內(nèi)切酶的特性相一

11、致;但是相比于還原端和非還原端，肝素酶Ⅲ對(duì)內(nèi)部糖苷鍵具有更高的切割偏好性。SPR分析表明，單純通過酶與底物間親和力大小來判斷酶對(duì)底物切割效率并不完全可取，因?yàn)楣烟堑孜锝Y(jié)構(gòu)、帶電荷情況極其復(fù)雜，從而可能會(huì)導(dǎo)致寡糖底物與酶的錯(cuò)誤結(jié)合而阻礙催化反應(yīng)。(3)肝素酶Ⅱ能夠切割含肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ作用位點(diǎn)的寡糖;除對(duì)含-GlcNS6S-GlcA-位點(diǎn)的寡糖切割效率高于肝素酶Ⅲ，肝素酶Ⅱ?qū)ζ渌嗡孛涪笞饔梦稽c(diǎn)寡糖的反應(yīng)活性低于肝素酶Ⅲ;肝素酶Ⅱ?qū)Ω?/p>