聚酮合成中酮基還原酶的底物特異性和立體選擇性研究.pdf

1、近年來，手性藥物在醫(yī)藥市場占有越來越重的份額，它巨大的應(yīng)用價(jià)值得到了各國科學(xué)家的關(guān)注，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。手性醇及其衍生物是合成手性藥物的前體，酮基化合物的不對(duì)稱還原是制備手性醇的重要手段。相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)還原，酶法還原因具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到大家的重視，而酶法還原最為關(guān)鍵的就是尋找合適的還原酶。
　　聚酮類化合物是由微生物或植物產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，是臨床藥物的重要來源。其生物合成過程

2、中涉及多步由酮還原酶（ketoreductase，KR）催化的酮基立體特異性還原，分別由聚酮合酶中酮還原酶域和聚酮后修飾酮還原酶負(fù)責(zé)。本文研究了多個(gè)不同聚酮生物合成途徑中的 KR作為生物催化劑合成手性醇的潛力，鑒定了其底物寬泛性，并對(duì)其立體特異性進(jìn)行深入研究，同時(shí)試圖利用 X射線晶體衍射技術(shù)解析酮還原酶的三維結(jié)構(gòu)，以確定催化中心參與底物結(jié)合的氨基酸殘基，研究結(jié)果如下：
　　1、三種不同聚酮合酶中的KR結(jié)構(gòu)域（BacKR1、TylK

3、R1和EryKR1），對(duì)八種不同底物的還原實(shí)驗(yàn)顯示不同 KR具有不同的底物譜和立體特異性，三種酶對(duì)天然底物類似物有一定的催化活性，不同的是 BacKR1對(duì)環(huán)己酮和4-氯苯乙酮有一定的催化活性，TylKR1對(duì)環(huán)己酮、苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-氟苯乙酮和乙酰乙酸乙酯有一定的催化活性，EryKR1對(duì)環(huán)己酮、苯乙酮和乙酰乙酸乙酯有一定的催化活性，三種酶在還原酮類底物的能力各具優(yōu)勢(shì)。此外，分別對(duì) TylKR1和 EryKR1的關(guān)鍵性氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)

4、突變后，TylKR1活性明顯降低，但都產(chǎn)生了2R，3R構(gòu)型的產(chǎn)物；而 EryKR1的構(gòu)型突變后有所改變，不僅有產(chǎn)生2S，3R構(gòu)型還產(chǎn)生了2R，3R構(gòu)型的產(chǎn)物，突變位點(diǎn)的改變確實(shí)影響了酶的立體選擇性，關(guān)鍵位點(diǎn)的改變亦影響了酶的活性。
　　2、采用親和層析和凝膠過濾層析法得到四種后修飾聚酮酮還原酶 DnrU、DnrE、MeiF和 Red1，利用 NADPH消耗法對(duì)四個(gè)蛋白進(jìn)行底物特異性研究，最終發(fā)現(xiàn) MeiF和DnrU能夠催化非天然底