酮基還原酶活性檢測方法的構(gòu)建及其發(fā)酵過程特性研究.pdf

1、光學(xué)活性手性醇是一種重要的手性合成子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、香精香料、食品添加劑、液晶等高附加值精細(xì)化學(xué)品合成中。生物催化潛手性羰基化合物的不對稱還原，由于具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，已成為獲取光學(xué)活性手性醇的有效途徑之一。酮基還原酶（KR）作為羰基還原酶中的重要成員之一，具有重要的研究價(jià)值。
　　首先，以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為底物，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)為輔酶，應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)法測定發(fā)酵液

2、中酮基還原酶活性，通過連續(xù)測定 NADPH消耗量來計(jì)算酶活力，得到了最佳反應(yīng)體系：粗酶液稀釋倍數(shù)為N（確保反應(yīng)在3~6分鐘完成），NADPH濃度為0.2 mmol/L，COBE濃度為1 mmol/L，磷酸緩沖溶液濃度為100 mmol/L、pH值為6，反應(yīng)溫度為40℃。在此條件下平行檢測5次酶活，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.48％。此方法操作簡便，耗時(shí)短，精確度高，重復(fù)性好，可作為發(fā)酵液中酮基還原酶活性測定方法加以推廣。
　　其次

3、，系統(tǒng)研究了碳源，氮源，金屬離子，磷酸鹽以及初始pH等因素對重組大腸桿菌產(chǎn)酮基還原酶的影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘油、酵母浸粉FM888與酵母蛋白胨 FP101混合物、(NH4)2SO4、MgSO4?7H2O、NaCl、ZnSO4?7H2O以及離子濃度為0.1mol/L pH7的磷酸緩沖液對菌體生長以及酶的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用；Plackett-Bunnan（PB）實(shí)驗(yàn)表明甘油、FM888與FP101混合物、MgSO4?7H2O以及磷酸鹽

4、為顯著因子；均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為：甘油6.86 g/L, FM88819.53 g/L, FP1018.37 g/L, MgSO4?7H2O2.50 g/L, K2HPO414.96 g/L, KH2PO47.34 g/L，(NH4)2SO44 g/L, NaCl0.25 g/L, ZnSO4?7H2O0.25 g/L。優(yōu)化后酮基還原酶酶活為231.21 U/mL，與優(yōu)化前（70.25 U/mL）比較提高了3.29倍，

5、較大幅度提高了酮基還原酶生產(chǎn)效率。
　　最后，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基利用到50 L發(fā)酵罐產(chǎn)KR的放大研究中，通過多參數(shù)分析研究了重組大腸桿菌 KR-C的生長規(guī)律以及菌體生長與產(chǎn)酶關(guān)聯(lián)性研究。結(jié)果表明：一方面，重組大腸桿菌KR-C生長代謝過程分為4個(gè)階段，分別為：延滯期（0-4 h），此階段為菌體的適應(yīng)期；對數(shù)生長期（4-8 h），此階段為菌體量積累期；穩(wěn)定期（8-10 h），此階段為酶的表達(dá)前期，乙酸積累期，二次增長期（10-12 h）

6、，此階段為酶大量積累期，乙酸消耗期；衰亡期(12 h后)，此階段為菌體衰亡，酶被降解期。另一方面，a）碳源的缺乏是發(fā)酵中期導(dǎo)致菌體提前進(jìn)入衰亡期的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致酮基還原酶表達(dá)時(shí)間縮短的關(guān)鍵因素；b）酮基還原酶的高效表達(dá)要以大量的活菌數(shù)和生長環(huán)境中較低的乙酸含量為基礎(chǔ)；c）對數(shù)生長期的比生長速率對酮基還原酶表達(dá)有很大的影響，將比生長速率控制在0.3 h-1以下有利于酶活的提高；d）發(fā)酵后期菌體自溶是酶活降低的主要原因。通過對重組大腸桿