α-酮基丁酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、α-酮基丁酸是合成多種有用化合物的前體物質(zhì)，如L-異亮氨酸、L-高丙氨酸及一些食品添加劑等，被廣泛應用于醫(yī)藥和食品添加行業(yè)。本文以蘇氨酸高產(chǎn)菌E.coliTHRD為出發(fā)菌株，以代謝工程理論為指導，成功構(gòu)建了α-酮基丁酸基因工程菌株。
　　首先在THRD基礎(chǔ)上，過量表達解除L-異亮氨酸反饋抑制的蘇氨酸脫水酶，使大腸桿菌具備了積累α-酮基丁酸的能力，菌株THRW搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為13.41 g/L，但在發(fā)酵液中檢測到大量的前體物蘇氨酸和副

2、產(chǎn)物丙酮酸。
　　為減弱前體物的外排能力，分別缺失蘇氨酸輸出蛋白RhtA和RhtC。發(fā)現(xiàn)敲除菌的蘇氨酸積累量均大幅下降，但只有RhtA的缺失（菌株THRW-1）有助于提高α-酮基丁酸產(chǎn)量，濃度為14.65 g/L，比THRW提高了9.25％。為阻斷α-酮基丁酸的代謝途徑，在THRW-1基礎(chǔ)上分別敲除基因ilvIH、 ilvBN、tdcE和avtA。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明單獨缺失基因ilvIH效果最好，菌株THRW-4產(chǎn)量達到16.44

3、g/L，提高了12.22％。利用7.5 L罐對THRW-4的誘導條件進行優(yōu)化，發(fā)酵10 h添加IPTG誘導，α-酮基丁酸積累量為27.91 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為16.42％，但是發(fā)酵液中仍有24.15 g/L的蘇氨酸存在。
　　向大腸桿菌THRW-4中引入甲基蘋果酸途徑，構(gòu)建了α-酮基丁酸雙代謝途徑菌株THRW-4-S1和THRW-4-S2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，兩株菌α-酮基丁酸產(chǎn)量均有提高且丙酮酸濃度明顯降低，證明甲基蘋果酸途徑發(fā)

4、揮了作用。
　　考慮到產(chǎn)物抑制作用是導致積累量偏低的關(guān)鍵節(jié)點，對重組菌THRW-4進行適應性進化實驗，以提升其對有毒目的產(chǎn)物α-酮基丁酸的耐受能力。突變株的菌體量較馴化前平均提高60％左右，但α-酮基丁酸產(chǎn)量下降70％。嘗試新的解決辦法，利用熱誘導型表達載體pBV220過表達蘇氨酸脫水酶獲得溫控重組菌株THRB-4（基因型同THRW-4），通過改變發(fā)酵溫度調(diào)控α-酮基丁酸的合成，該誘導系統(tǒng)具有操作簡單、利于基因大規(guī)模表達等優(yōu)點。T