糖多孢紅霉菌酮還原酶基因的克隆及其在手性醇中的應(yīng)用.pdf

1、具有特定功能基團(tuán)的手性醇是合成手性藥物的重要中間體，從羰基化合物不對(duì)稱(chēng)還原合成手性醇，已成為手性合成的一個(gè)重要部分。在羰基的不對(duì)稱(chēng)催化還原反應(yīng)研究中，生物催化以其溫和的反應(yīng)條件、對(duì)環(huán)境的壓力較小和較高的光學(xué)選擇性，在羰基不對(duì)稱(chēng)還原合成中占有很重要的地位。選擇合適的生物催化劑對(duì)于生物催化至關(guān)重要。2006年Bali等報(bào)道了短鏈脫氫酶家族(short-chaindehydrogenasesuperfamily，SDR)成員之一的糖多孢紅霉菌

2、聚酮合成酶中的酮還原酶對(duì)很多的底物，都有比較好的生物選擇性還原能力，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物。 本實(shí)驗(yàn)以糖多孢紅霉菌基因組作為DNA供體，并根據(jù)2005年Alexandros的報(bào)道設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增野生型的糖多孢紅霉菌聚酮合成酶中的酮還原酶域基因(eryKR1)。再根據(jù)Genbank中報(bào)道的eryKR1基因和放線(xiàn)菌素聚酮合成酶中的酮還原酶基因(ActKR)，設(shè)計(jì)了用于定點(diǎn)突變的特異性引物，利用重疊PCR技術(shù)將KR1中決定

3、其底物特異性的位點(diǎn)定點(diǎn)突變?yōu)锳ctKR中決定其底物專(zhuān)一性的那段基因位點(diǎn)，得到突變的KR1片段命為eryKR1M。將其克隆到表達(dá)載體pET-28a上，從中挑選陽(yáng)性克隆菌株pET-eryKR1和pET-eryKR1M進(jìn)行測(cè)序。用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GDH作為輔酶再生。將重組質(zhì)粒pET-GDH，pET-eryKR1和pET-eryKR1M轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。加定量的IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白

4、的表達(dá)。最后通過(guò)發(fā)酵檢驗(yàn)野生型和突變后的酮還原酶對(duì)四種底物(4-氯乙酰乙酸乙酯，苯乙酮，2-辛酮和環(huán)己酮)還原作用。 結(jié)果表明，擴(kuò)增eryKR1，eryKR1M基因的最佳退火溫度為68℃，GDH基因的最佳退火溫度為54℃。擴(kuò)增的eryKR1，eryKR1M和GDH基因所對(duì)應(yīng)的蛋白序列與報(bào)道的同源性高達(dá)98％。pET-eryKR1M中的目標(biāo)基因與Genbank中報(bào)道的KR1基因僅在控制底物專(zhuān)一性的位點(diǎn)處不同，被放線(xiàn)菌素聚酮合成酶中