羰基還原酶的挖掘和改造.pdf

1、手性醇被廣泛用于合成手性藥物、精細化學品和農(nóng)用化學品，是最重要的手性砌塊之一。生物催化潛手性酮不對稱還原合成手性醇因具有理論產(chǎn)率高、選擇性好、副產(chǎn)物少和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點而成為手性醇綠色合成的優(yōu)選途徑。然而，大多數(shù)生物催化劑還原潛手性酮的過程遵循Prelog規(guī)則，具有anti-Prelog立體選擇性的生物催化劑相對稀缺。鑒于此，本論文以開發(fā)高效的anti-Prelog立體選擇性生物催化劑為目標，開展了包括菌種篩選、基因挖掘、蛋白表達、酶

2、催化性質(zhì)表征和理性設(shè)計改造酶催化性能等方面的研究。
　　利用傳統(tǒng)菌種篩選策略，從土壤中分離得到具有anti-Prelog立體選擇性的微生物菌株ZJUY-1401;經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株為短穩(wěn)桿菌(Empedobacter brevis)。短穩(wěn)桿菌ZJUY-1401能夠高立體選擇性不對稱還原一系列苯乙酮衍生物，催化底物譜寬泛;另一方面，該菌株可利用相對廉價的NADH作為輔酶，且能夠以乙醇作為輔底物實現(xiàn)輔

3、酶再生，具有良好的乙醇耐受性和pH適應(yīng)性，因而具備了anti-Prelog手性醇高效合成工具的潛質(zhì)。
　　通過基因組狩獵法分別從E.brevis ZJUY-1401和Pseudomonas putida ATCC12633基因組中挖掘并克隆了羰基還原酶基因Ebsdr8和Ppysdr，并成功實現(xiàn)了相應(yīng)編碼蛋白EbSDR8和PpYSDR在E.coli BL21(DE3)中的異源表達。氨基酸序列分析表明兩者均屬于短鏈脫氫酶家族，具有該家

4、族蛋白高度保守的富甘氨酸“指紋”序列GXXXGXG、催化三聯(lián)體Ser-Tyr-Lys和活性位點模體YXXXK。EbSDR8不對稱還原苯乙酮的產(chǎn)物為(R)-苯乙醇，ee值高達99.9％;而PpYSDR催化苯乙酮還原的主要產(chǎn)物為(S)-苯乙醇，ee值為84.2％。為了便于在后續(xù)研究中深入認識兩個酶催化性能和結(jié)構(gòu)間關(guān)系，通過同源建模分別構(gòu)建了具有高可信度的三級結(jié)構(gòu)模型，兩者均具有短鏈脫氫酶家族蛋白典型的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)。
　　考

5、察EbSDR8和PpYSDR的酶學性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，兩者均可利用NADH和NADPH作為輔酶催化潛手性酮的還原，但NADH作為輔酶時的催化性能優(yōu)于NADPH;兩者均能以異丙醇作為輔底物實現(xiàn)輔酶再生進而加速反應(yīng)進行。EbSDR8和PpYSDR的最適反應(yīng)溫度分別為35℃和30℃，最適反應(yīng)pH均為7.5;值得注意的是，EbSDR8能夠在較寬pH范圍(7.O～10.5)催化反應(yīng)進行，具有良好的pH適應(yīng)性。另一方面，EbSDR8和PpYSDR重組大腸桿菌

6、全細胞能夠在無外源輔酶添加的體系中高效催化一系列潛手性酮的不對稱還原，但其立體選擇性相反，分別遵循anti-Prelog和Prelog規(guī)則;分子水平的分析表明，兩者底物結(jié)合口袋幾何構(gòu)型和大小的顯著差異是導致其立體選擇性不同的關(guān)鍵因素，底物結(jié)合口袋的幾何構(gòu)型決定了底物的結(jié)合模式和取向定位，而結(jié)合口袋大小則影響了底物分子的自由旋轉(zhuǎn)，兩者共同決定了酶的立體選擇性。
　　基于對EbSDR8和PpYSDR底物結(jié)合口袋幾何構(gòu)型和氨基酸殘基組成

7、的比較及分子對接結(jié)果的分析，制定了減小空間位阻并建立/消除分子間相互作用的酶立體選擇性調(diào)控策略。該策略的運用成功將PpYSDR還原一系列鹵代苯乙酮的立體選擇性從遵循Prelog規(guī)則轉(zhuǎn)變?yōu)樽裱璦nti-Prelog規(guī)則，特別是突變體M85T/L136E和M85V/M187D還原3'，5'-雙（三氟甲基）苯乙酮以及M85T/W182V和M85V/L136V還原2，2，2-三氟苯乙酮的立體選擇性完全反轉(zhuǎn)，相應(yīng)anti-Prelog手性醇ee值

8、達95％以上。通過分子對接逆向分析發(fā)現(xiàn)，突變位點的引入確實有效地執(zhí)行了所設(shè)計的立體選擇性調(diào)控策略，空間位阻的變化以及芳香環(huán)和鹵素原子參與的分子間作用力在酶立體選擇性反轉(zhuǎn)的發(fā)生和穩(wěn)定中發(fā)揮了重要作用。利用理性設(shè)計實現(xiàn)PpYSDR立體選擇性反轉(zhuǎn)不僅有助于加深對此類酶立體選擇性調(diào)控機制的理解，同時也拓寬了anti-Prelog立體選擇性生物催化劑的來源。
　　通過詳細分析潛手性酮與EbSDR8分子對接結(jié)果，選取可能影響EbSDR8催化活

9、性的氨基酸殘基作為突變位點，并根據(jù)所選位點的氨基酸殘基性質(zhì)、與底物間的相互作用和對底物結(jié)合口袋構(gòu)型的影響等，有針對性地設(shè)計了一系列突變體。所設(shè)計的單點突變G94A和S153L分別提高了EbSDR8的催化活性，且這兩個位點的突變對催化活性的提高表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，其組合突變G94A/S153L還原潛手性酮的催化效率顯著提高，特別是其還原苯乙酮和4'-甲氧基苯乙酮的催化效率均達到野生型EbSDR8的15倍以上。分子對接和動力學模擬結(jié)果表明