典型三苯甲烷還原酶的細(xì)胞表面展示及新型雙功能染料還原酶的挖掘和底物識(shí)別機(jī)制研究.pdf

1、印染廢水水量大、水溫高、成分復(fù)雜等特性對(duì)現(xiàn)有的生物處理方法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此尋找高效、穩(wěn)定、低成本、廣譜的印染廢水處理方案成為了當(dāng)務(wù)之急。本研究旨在通過構(gòu)建染料高效降解酶的表面展示系統(tǒng)，既可以解決染料跨膜運(yùn)輸?shù)碾y題，又可以降低廢水處理成本，為染料降解酶的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)本研究通過基因組挖掘獲得了一個(gè)可以同時(shí)降解三苯甲烷和偶氮染料的還原酶，并部分闡明了其底物識(shí)別機(jī)制，對(duì)具有底物廣譜性的染料降解酶類的改造具有重要意義。論文主要

2、研究結(jié)果如下:
　　1)重組三苯甲烷還原酶CsTMR為同源二聚體，最適pH和溫度分別為8.5和55℃，在45℃以下處理半小時(shí)后保持穩(wěn)定，在5.0-10.0的pH范圍內(nèi)處理后可以保持其初始活性的50％以上。總體而言，該酶活性和穩(wěn)定性較好，適合作為固定化或表面展示的對(duì)象來為染料廢水的降解研究提供新的思路。
　　2)以來自Pseudomonas borealis的冰晶核蛋白N端(InaPb-N)作為錨定蛋白，構(gòu)建CsTMR大腸桿菌

3、表面展示系統(tǒng)。約有85％的外源蛋白被成功展示在大腸肝菌外膜上，表面展示CsTMR對(duì)孔雀石綠的脫色速率達(dá)到了640μtmol min-1 g-1DWC。表面展示酶的穩(wěn)定性比游離純酶顯著提高，特別是長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在我們進(jìn)一步嘗試構(gòu)建輔酶再生體系，利用InaPB-N介導(dǎo)的葡萄糖脫氫酶DS255表面展示系統(tǒng)時(shí)，在胞外檢測(cè)不到GDH活性，說明DS255沒有被成功展示。
　　3)利用cotG作為分子載體構(gòu)建枯草芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)，將CsT

4、MR和DS255成功展示在芽孢表面。與純酶相比，兩種表面展示的蛋白對(duì)pH和溫度的耐受范圍更廣，且具有更好的穩(wěn)定性。利用表面展示的CsTMR和DS255的芽孢，作為全細(xì)胞催化劑構(gòu)建輔酶再生體系，根據(jù)不同的參數(shù)得出整個(gè)體系需要較高比例的芽孢展示DS255才能夠滿足CsTMR對(duì)于NADH的需求，從而達(dá)到較高的降解速率。
　　4)以CsTMR氨基酸序列為探針，通過數(shù)據(jù)庫挖掘，從Geobacillusthermoglucosidasius

5、C56-YS93的得到一個(gè)可能編碼三苯甲烷還原酶的基因，根據(jù)其底物特異性將其命名為GtAZR。重組GtAZR在pH5.5和40℃條件下具有最大活性，在低于65℃的溫度下保持穩(wěn)定，同時(shí)它也具有較廣的pH耐受范圍。該酶對(duì)有機(jī)溶劑有非常高的耐受性。此外，GtAZR底物譜較廣，能同時(shí)降解三苯甲烷和偶氮類染料。GtZAR強(qiáng)大的穩(wěn)定性和底物廣譜性使它在處理實(shí)際混合染料廢水中有著極好的應(yīng)用前景。
　　5)通過同源建模、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬和