嗜酸硫化芽孢桿菌硫氧化還原酶的功能研究.pdf

1、嗜酸硫化芽孢桿菌(Sulfobacillus acidophilus TPY)是一株分離自太平洋熱液口，中等嗜熱嗜酸的革蘭氏陽性菌，既能利用亞鐵鹽、單質(zhì)硫自養(yǎng)生長，也能利用酵母粉、葡萄糖、蛋白胨和甘油等有機物異養(yǎng)生長。因此，TPY菌株對亞鐵和單質(zhì)硫的良好氧化能力顯示出其在生物浸礦中的應用潛力。嗜酸硫化芽孢桿菌的硫氧化還原酶在有氧條件下催化單質(zhì)硫反應生成亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽和硫化氫。
　　為研究硫氧化還原酶在硫氧化過程中的作用，克隆

2、硫氧化還原酶基因，并表達純化，復性得到有活性的硫氧化還原酶，經(jīng)過亞甲基藍比色法驗證體外制備的硫氧化還原酶是有活性的。并憑借免疫共沉淀技術研究硫氧化還原酶的功能，挖掘出組氨酸蛋白激酶與硫氧化還原酶的關系密切。
　　通過定點突變技術，發(fā)現(xiàn)嗜酸硫化芽孢桿菌硫氧化還原酶(SOR)的活性位點(C31、C101、C104、H86、H90、E114)與已報道的古菌及革蘭氏陰性菌的相似，而六個活性位點突變蛋白的活性與已報道的古菌及革蘭氏陰性菌的差

3、別較大，這也正體現(xiàn)了這個來自于革蘭氏陽性菌的硫氧化還原酶的特殊性。
　　首先構建出可轉(zhuǎn)移的表達載體pTrc99A_sor_oriT，通過接合轉(zhuǎn)移的方法，將所構建的載體成功轉(zhuǎn)入了嗜酸硫化芽孢桿菌中，構建了嗜酸硫化芽孢桿菌基因工程菌S.a cidoph ilus(p Trc99A_sor_oriT)，并對基因工程菌的硫氧化活性及理化參數(shù)進行了檢測。實驗結果表明，無論是以FeSO4還是S為能源物質(zhì)的培養(yǎng)基上，嗜酸硫化芽孢桿菌基因工程菌S

4、.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)的硫氧化活性有一定程度的提高，這也充分說明，通過提高硫氧化途徑的起始酶SOR的表達量，可以提高嗜酸硫化芽孢桿菌的硫氧化活性。
　　為了進一步探究基因工程菌硫氧化活性提高的原因，運用熒光定量PCR技術對基因工程菌中硫代謝相關基因的表達水平進行了研究。結果表明，在基因工程菌S.acidophf lus(p Trc99A_sor_oriT)中，除了質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達水

5、平有提高以外，硫代謝的其它相關基因的表達水平也有一定的變化。在FeSO4為能源物質(zhì)的SA培養(yǎng)基上，基因工程菌S.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)中，只有質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達水平提高了，其它硫代謝基因表達水平下調(diào)。在S為能源物質(zhì)的SA培養(yǎng)基上，基因工程菌S.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)中，除了質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達水平提高了，其它硫代謝基因表達水平也得到一定程度的提高，