副豬嗜血桿菌二硫鍵氧化還原酶DsbA生化特性和功能的初步研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）為格拉瑟氏病（Gl(a)sser's disease）病原，定殖于豬上呼吸道，該菌可引發(fā)以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的系統(tǒng)性疾病。DsbA為二硫鍵氧化還原酶，參與催化蛋白二硫鍵的折疊，通過影響蛋白的高級結(jié)構(gòu)而影響蛋白的活性和功能，細(xì)菌能編碼不同數(shù)量和不同類型的DsbA同系物。副豬嗜血桿菌中存在兩個DsbA，DsbA1與E.coll K-12的DsbA氨基酸一致性為47％，

2、DsbA2與EcDsbA不具有氨基酸相似性，兩者的功能尚未見任何文獻(xiàn)報(bào)道，其在副豬嗜血桿菌中的作用有待研究。
　　本課題試圖構(gòu)建副豬嗜血桿菌SH0165菌株ΔdsbA基因缺失株和互補(bǔ)菌株，通過生化特性分析和基因功能的初步研究探索DsbA在副豬嗜血桿菌中所發(fā)揮的作用。具體過程如下:
　　1、dsbA基因缺失株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
　　首先，以SH0165基因組為模板PCR擴(kuò)增dsbA1和dsbA2基因的上下游同源臂，并以pS

3、HK3和pAT18質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增kan片段和erm片段，通過重疊PCR將同源臂與對應(yīng)的抗性片段重疊連接，分別克隆至自殺性質(zhì)粒pK18和穿梭質(zhì)粒pSHK3中，成功構(gòu)建了pK18-dsbA1-UKD、pK18-dsbA2-UED、pSHK3-dsbA1-UKD、pSHK3-dsbA2-UED重組質(zhì)粒，最終由自然轉(zhuǎn)化成功獲得ΔdsbA1和ΔdsbA2基因缺失株。
　　其次，本課題將dsbA1編碼序列及其上游啟動子和下游終止子序列克隆

4、至pSHK3穿梭載體構(gòu)建pSHK3-C-dsbA1質(zhì)粒，pSHK3-C-dsbA1經(jīng)體外甲基化后電轉(zhuǎn)入ΔdsbA1中成功獲得互補(bǔ)菌株。
　　2、DsbA1和DsbA2生化特性研究
　　首先，測定SH0165、ΔdsbA1和ΔdsbA2各菌株在不同CuCl2濃度(0～10mM)OD600的變化情況，在菌體內(nèi)檢測DsbA1和DsbA2的異構(gòu)酶活性。結(jié)果顯示SH0165、ΔdsbA1和ΔdsbA2的OD600隨著銅離子濃度的增加不

5、斷減小，但減小趨勢一致，即各菌株對銅的敏感程度一致。推測DsbA1和DsbA2均不是二硫鍵還原/異構(gòu)酶，不能異構(gòu)由銅造成的蛋白的錯誤折疊。
　　其次，在pET28a載體中構(gòu)建DsbA1、DsbA2和TrxA（陽性對照）原核表達(dá)重組質(zhì)粒，表達(dá)并純化，純化的蛋白用于胰島素還原實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示異構(gòu)酶TrxA（還原酶）、DsbA1和DsbA2均能催化DTT對胰島素的還原作用，DsbA1和DsbA2催化速率低于異構(gòu)酶TrxA，出現(xiàn)了20min

6、的滯后。證實(shí)DsbA1和DsbA2不是二硫鍵異構(gòu)酶。
　　最后，測定SH0165、ΔdsbA1和ΔdsbA2菌株在1mM DTT濃度下的存活情況。結(jié)果顯示SH0165和ΔdsbA2對DTT的敏感程度一致，而ΔdsbA1顯著比SH0165和ΔdsbA2對DTT更敏感。推測DsbA1是二硫鍵氧化折疊酶能抵抗DTT的還原作用。
　　3、dsbA1缺失對SH0165生長的影響
　　繪制SH0165、ΔdsbA1和C-dsbA1

7、的生長曲線初步探究dsbA1是否對菌株生長產(chǎn)生影響。結(jié)果表明當(dāng)缺失dsbA1基因后，ΔdsbA1的OD600值和活菌量均顯著低于SH0165，而dsbA1基因互補(bǔ)后，缺失株的生長表型得到了部分提高?？芍猟sbA1的缺失影響了SH0165的生長。
　　通過掃描電鏡進(jìn)一步觀察dsbA1缺失對生長的影響。本研究選取平板培養(yǎng)至6h、12h和24h的SH0165和ΔdsbA1菌苔觀察菌體形態(tài)。比較發(fā)現(xiàn)，在6h和12h時ΔdsbA1部分細(xì)菌形

8、態(tài)明顯變長，而在24h時得到恢復(fù)。推測dsbA1缺失影響細(xì)菌分裂導(dǎo)致生長滯后。
　　鐵螯合生長實(shí)驗(yàn)初步探究dsbA1影響SH0165生長的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)加入不同濃度的Dip（250μM和300μM）螯合鐵源，檢測各菌株在鐵限制環(huán)境下的生長情況。結(jié)果顯示:在相同Dip濃度下，ΔdsbA1的存活情況明顯弱于SH0165，dsbA1缺失影響菌株在鐵限制環(huán)境下的生長。
　　4、dsbA1其它功能研究
　　本課題通過血清抗性實(shí)驗(yàn)探