二硫鍵氧化還原酶DsbA-DsbC介導重組瑞替普酶在大腸桿菌中可溶表達研究.pdf

1、瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓藥物，是由第二代溶血栓藥物t-PA經(jīng)基因工程技術(shù)改造而來，只保留了kringleⅡ和蛋白酶兩個結(jié)構(gòu)域以及N末端的3個氨基酸。由于reteplase結(jié)構(gòu)中含有9對二硫鍵，因而重組reteplase在E.coli中表達時極易形成包涵體。本文引入二硫鍵氧化還原酶DsbA/DsbC與reteplase共表達，介導其折疊過程中二硫鍵的氧化形成和錯配二硫鍵的還原異構(gòu)，從而促進其在E.coli中的可溶表達，

2、并對reteplase折疊機理進行探討。
　　首先根據(jù)E.coli的密碼子偏好性對reteplase基因序列進行了密碼子優(yōu)化，并克隆到pBAD/HisA和pACYCDuet-1上，構(gòu)建了DsbA、DsbC和DsbA/DsbC三種共表達體系。
　　在此基礎(chǔ)上，考察了發(fā)酵過程中誘導方式及時間、培養(yǎng)溫度、誘導劑濃度等對reteplase可溶表達量的影響。通過對操作條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了reteplase在E.coil中的可溶表達。在3

3、7℃、200 rpm的條件下培養(yǎng)到OD600值為0.6左右時，加入0.1mM的IPTG誘導DsbA/DsbC的表達;之后在25℃、160 rpm的條件下繼續(xù)培養(yǎng)1h后，加入0.5 g/L的L-阿拉伯糖誘導目標蛋白reteplase表達，繼續(xù)培養(yǎng)10h收獲菌體，結(jié)果表明DsbC共表達體系有近60％的reteplase實現(xiàn)了可溶表達，其產(chǎn)量約為70 mg/L發(fā)酵液。
　　菌體破胞后，將上清液用鎳離子親和層析柱分離純化reteplase

4、，得到了較高純度的reteplase。利用熒光光譜法對可溶reteplase的結(jié)構(gòu)進行表征，發(fā)現(xiàn)可溶reteplase的三級結(jié)構(gòu)與標準品高度一致。用平板溶圈法測得純化后reteplase的活性為2.35×105 IU/mg。最后對reteplase在DsbC的協(xié)助下二硫鍵異構(gòu)化的兩種途徑進行了探討，并闡述了異構(gòu)化模型。
　　本文通過共表達氧化還原酶DsbA/DsbC實現(xiàn)了reteplase在E.coli中的可溶表達，有助于rete