嗜酸氧化亞鐵硫桿菌浸礦過程鐵硫代謝體系的研究.pdf

1、環(huán)境友好高效的生物冶金技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用和發(fā)展亟需理論的突破以給生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)，但由于對(duì)生物因素了解的局限性及生物冶金體系本身的復(fù)雜性一直妨礙了人們對(duì)生物冶金體系的全局的理解。本論文運(yùn)用序列比對(duì)與識(shí)別、同源模建、進(jìn)化蹤跡分析、途徑網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)、分子模擬、量子化學(xué)計(jì)算、靜電勢(shì)分析、分子對(duì)接等生物信息學(xué)和分子計(jì)算方法，結(jié)合蛋白質(zhì)表達(dá)純化和定點(diǎn)突變與表征等技術(shù)，對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，簡(jiǎn)稱

2、A，f菌)在浸礦過程中利用鐵硫能源驅(qū)動(dòng)生物體合成的鐵硫代謝能量傳遞過程進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，構(gòu)建了其能量傳遞途徑網(wǎng)絡(luò)圖，解釋了單個(gè)A，f菌如何浸礦。此外，對(duì)硫化礦生物浸出體系及其能量傳遞耦合的產(chǎn)酸問題進(jìn)行了分析。論文的具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果可概括為五個(gè)方面： 一.A.f卣的若干能量傳遞蛋白的結(jié)構(gòu)分析與反應(yīng)機(jī)理預(yù)測(cè)。 細(xì)胞色素c：A.f菌有10個(gè)細(xì)胞色素c，聚類分析表明它們分成4大同源蛋白類。其中4個(gè)周質(zhì)細(xì)胞色素C4家族蛋白的序列

3、結(jié)構(gòu)比較表明位于Cycl的Tyr63和Glu121位點(diǎn)附近的殘基差異決定它們的功能差異。 細(xì)胞色素bc1復(fù)合體：A.f菌有2個(gè)細(xì)胞色素bc1復(fù)合體，對(duì)它們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模建和機(jī)理探討，序列和結(jié)構(gòu)比較顯示了它們?cè)诩?xì)胞色素b亞基位于血紅素bL輔基近溶液外側(cè)的Arg79位點(diǎn)存在差異，這可能導(dǎo)致了它們的正反向功能差異。 終端氧化酶：A.f菌有4個(gè)終端氧化酶，對(duì)它們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模建和機(jī)理探討，結(jié)果表明，細(xì)胞色素aa3和ba3復(fù)合體的電子

4、供體是周質(zhì)細(xì)胞色素c；細(xì)胞色素bo3和bd復(fù)合體的電子供體是泛醌。 細(xì)胞色素CycA1:模建了三維分子結(jié)構(gòu)，它包含2個(gè)血紅素輔基。 細(xì)胞色素Cyc2_like蛋白：生物信息學(xué)分析表明它是定位于外膜含一個(gè)血紅素的高分子量細(xì)胞色素蛋白。 硫化物泛醌還原酶(SQR): SQR的結(jié)構(gòu)尚未解析，模建了A.f菌源SQR三維分子結(jié)構(gòu)，并跟黃素(FAD)和泛醌(UQ)進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)這些結(jié)果提出了其反應(yīng)機(jī)理。 基因do

5、xDA：對(duì)A，f菌doxDA-1與doxDA-2基因的生物信息學(xué)分析表明它們是融合基因。 DsbG蛋白：結(jié)構(gòu)模建結(jié)果表明，二聚體DsbG蛋白中的兩個(gè)單體對(duì)稱結(jié)合，2個(gè)保守的Cys119和Cys122殘基的位置遠(yuǎn)離二聚體DsbG蛋白的接觸面，但它們的位置十分接近。 核糖-5-磷酸異構(gòu)酶：模建了三維分子結(jié)構(gòu)并跟底物R5P進(jìn)行了分子對(duì)接，根據(jù)對(duì)接結(jié)果識(shí)別了催化的關(guān)鍵殘基，提出了其反應(yīng)機(jī)理。 谷胱甘肽還原酶：模建了三維

6、分子結(jié)構(gòu)并跟底物進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)對(duì)接結(jié)果識(shí)別了催化的關(guān)鍵殘基，提出了其反應(yīng)機(jī)理。 二.A，f菌的若干能量傳遞蛋白的結(jié)構(gòu)模建與表達(dá)驗(yàn)證。 銅藍(lán)蛋白：靜電勢(shì)分析、活性位點(diǎn)量化計(jì)算和蛋白質(zhì)表達(dá)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)殘基Cys138對(duì)結(jié)合銅原子非常重要。 亞鐵氧化酶(Iro): Iro的結(jié)構(gòu)尚未解析，模建了A.f菌源Iro結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明它是由4個(gè)半胱氨酸配位[Fe4S4]鐵硫簇的高電位鐵硫蛋白(HiPIP)家族蛋白，對(duì)離鐵硫

7、簇十分近的Tyr10虛擬突變實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)了該位置處的芳香環(huán)對(duì)保護(hù)鐵硫簇起重大作用，蛋白質(zhì)的表達(dá)純化及定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)論。 高電位鐵硫蛋白：結(jié)構(gòu)模建表明它含有4個(gè)半胱氨酸配位的[Fe4S4]鐵硫簇；蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)表明它含有鐵硫簇活性中心；定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)的殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇。 亞硫酸還原酶：模建了它的黃素蛋白(SiR-FP)和血紅素蛋白(SiR-HP)的三維分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，SiR-HP

8、中4個(gè)保守的Cys427，Cys433，Cys472和Cys476殘基配位位于單體結(jié)構(gòu)的中心的[Fe4S4]鐵硫簇，血紅素位于鐵硫簇附近。蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)表明SiR-FP含有[Fe4S4]鐵硫簇活性中心和血紅素基團(tuán)，定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)預(yù)測(cè)的殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇。 APS還原酶：結(jié)構(gòu)模建結(jié)果表明它含有由4個(gè)保守的Cys110，Cys111，Cys193和Cys196殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇，底物APS分子對(duì)接的結(jié)果顯

9、示其位置就在附近。蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)表明它含有鐵硫簇活性中心。 鐵硫簇組裝供硫蛋白(IscS):模建了A.f菌源IscS的完整的三維分子結(jié)構(gòu)，跟輔因子PLP和底物半胱氨酸分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)了一些重要?dú)埢?；蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)A.f菌源的IscS是一個(gè)半胱氨酸脫硫酶，它依賴PLP，催化L型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成L型丙氨酸和硫烷硫，為鐵硫簇組裝供硫。 鐵硫簇組裝蛋白(IscA): IscA可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]鐵硫簇

10、，結(jié)構(gòu)模建和蛋白的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明A.f菌源IscA含有由Cys35，Cys99，Cys101和Glu103配位的[Fe4S4]鐵硫簇。 鐵硫簇支架蛋白(IscU)：IscU可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]鐵硫簇，結(jié)構(gòu)模建和蛋白的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明A.f菌源IscU含有由Cys37，Cys63，Cys106和Asp39配位的[Fe2S2]鐵硫簇。 鐵氧還蛋白：鐵氧還蛋白可能含[Fe4S4]，[Fe3S4]或[F

11、e2S2]鐵硫簇，結(jié)構(gòu)模建表明它是由4個(gè)半胱氨酸殘基Cys42，Cys48，Cys51和Cys87配位[Fe2S2]的鐵硫蛋白；蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)表明A.f菌源的鐵氧還蛋白正確插入[Fe2S2]鐵硫簇；定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)的殘基配位[Fe2S2]鐵硫簇。 超氧化物歧化酶：進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)模建和進(jìn)化蹤跡分析，它的活性中心由Cys35，Cys99，Cys101和Glu103配位鐵原子組成；蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)表明它是含鐵超氧化物歧

12、化酶。 中鏈乙酰輔酶A脫氫酶：它及其Y375K突變體與乙酰輔酶A的分子對(duì)接比較研究和蛋白表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果表明，中鏈乙酰輔酶A脫氫酶的Tyr375突變成Lys375使其獲得了乙酰輔酶A氧化酶活性。 乙酰輔酶A氧化酶：分子對(duì)接預(yù)測(cè)和蛋白的表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果表明Oct-2-en-4-ynoyl-CoA是它的一個(gè)特異性抑制劑。 三.A.f菌的若干多拷貝能量傳遞蛋白的分子多樣性。 在三維分子結(jié)構(gòu)層次考察了A.f菌的細(xì)胞色素C

13、4類蛋白、銅藍(lán)蛋白、高氧還電位鐵硫蛋白、硫化物泛醌還原酶在不同菌株和相同菌株的不同拷貝間的分子多樣性。結(jié)果表明相同菌株的不同拷貝蛋白間的差異處于分子的局部；不同菌株同一蛋白間的差異為數(shù)個(gè)遠(yuǎn)離活性中心的殘基，但有少數(shù)在活性中心附近發(fā)生突變。 四.A.f菌浸礦過程鐵硫代謝的能量傳遞網(wǎng)絡(luò)圖。 對(duì)A.fATCC23270全基因組涉及鐵硫代謝能量傳遞的二百多個(gè)基因和三十多個(gè)多基因操縱子進(jìn)行了系統(tǒng)地分析，結(jié)合前面各部分的研究結(jié)果和已

14、有文獻(xiàn)的研究成果，構(gòu)建了A.f菌浸礦過程鐵硫代謝能量傳遞網(wǎng)絡(luò)圖。它包括礦物的分解，溶液中的反應(yīng)，A.f菌的呼吸鏈、亞鐵氧化、硫代謝、二氧化碳固定、氮?dú)夤潭皻錃饫玫炔糠?。圖中對(duì)所涉及蛋白的同工酶和多拷貝蛋白的個(gè)數(shù)及一些重要反應(yīng)的氧還電勢(shì)也進(jìn)行了標(biāo)注。通過這個(gè)圖，可明白單個(gè)A.f菌如何浸礦。 五.硫化礦生物浸出體系的分析及產(chǎn)酸問題。 以生成新物質(zhì)的流量為切入點(diǎn)，系統(tǒng)地分析了硫化礦生物浸出體系，該體系的變化主要由鐵硫碳氮氧