產(chǎn)羰基還原酶工程菌的發(fā)酵及重組羰基還原酶的酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、隨著醫(yī)藥、食品、精細(xì)化工等行業(yè)對(duì)光學(xué)純手性中間體需求的不斷增長(zhǎng)，人們已經(jīng)充分意識(shí)到手性化合物的重要性。酶法生物催化生成手性化合物因其具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。因而進(jìn)一步研究該轉(zhuǎn)化過程的酶反應(yīng)機(jī)制，酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，具有非常重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。本文從實(shí)驗(yàn)室保藏的三株前期構(gòu)建的重組大腸桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，篩選出酶活最高的E.coliBL21(pET30a-cr318)。通過搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，大量獲得該酶，并在此

2、基礎(chǔ)上進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理研究。
　　(1)經(jīng)過對(duì)重組大腸桿菌E coli BL21(pET30a-cr318)搖瓶培養(yǎng)的研究，得到優(yōu)化后的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件。優(yōu)化后培養(yǎng)基組成:葡萄糖1％，蛋白胨1.5％，酵母粉0.5％，pH=7.5，微量元素濃度1mL/L。優(yōu)化后培養(yǎng)條件:搖瓶裝液量50mL/250 mL，接種量5％。誘導(dǎo)條件:誘導(dǎo)時(shí)間2h，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間8h，誘導(dǎo)劑濃度1nmol/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下

3、培養(yǎng)該重組菌，比酶活為0.78 U/mg，是未優(yōu)化前的1.6倍。
　　(2)在15 L發(fā)酵罐中對(duì)重組菌Ecob BL21(pET30a-cr318)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并且建立分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。在分批發(fā)酵基礎(chǔ)上再用pH-stat補(bǔ)料分批發(fā)酵，最大菌體密度達(dá)到22.7 g/L(DCW)，是分批發(fā)酵的2.15倍;酶活為39.34U/mL，是分批發(fā)酵的3.7倍。
　　(3)對(duì)高壓破胞和超聲破胞兩種破胞工藝進(jìn)行優(yōu)化和比較。高壓破胞優(yōu)化后

4、的工藝條件:破碎時(shí)間6 min，菌體濃度0.083 gmL，破胞得到的酶活0.65 U/mg，破胞率97.5％。超聲破胞的優(yōu)化工藝條件:功率900 W，破碎時(shí)間12 min，菌體濃度為0.083 g/mL，得到的酶活0.48 U/mg，破胞率82.3％，分別是高壓破胞的74％和84％。
　　(4)羰基還原酶經(jīng)鎳柱層析純化后酶活提高8.64倍，但酶活回收率只有58.3％。SDA-PAGE電泳顯示該羰基還原酶的亞基分子量為30 kDa

5、。探究鎳柱層析純化后羰基還原酶的酶學(xué)性質(zhì)，其酶學(xué)性質(zhì)如下:羰基還原酶是NADPH依賴型酶;最適反應(yīng)溫度為35℃，溫度超過35℃后酶活低于最高酶活的60％;最適反應(yīng)pH為7.0，pH穩(wěn)定范圍為5.5～7.5; K+、Ca2+、Na+和Mn2+對(duì)酶有激活作用，EDTA使酶活降低;加入有機(jī)溶劑均能降低羰基還原酶的酶活，在乙醇中相對(duì)穩(wěn)定，但在吡啶、乙腈和四氫呋喃中都極度不穩(wěn)定。
　　(5)研究羰基還原酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)后發(fā)現(xiàn)羰基還原酶催化反