人類羰基還原酶基因CBR1和DCXR的克隆及其編碼蛋白的功能研究.pdf

1、肝癌為我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，尋找和鑒定肝癌相關(guān)基因并研究它們的生物學(xué)功能，將有助于揭示肝癌的發(fā)生機制并為藥物治療提供選擇藥物的依據(jù)。羰基還原酶(CBRs，EC1．1．1．184)參與還原包括醌在內(nèi)的各種羰基化合物，在解除細(xì)胞內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物或外源性化合物的毒性效應(yīng)方面起著重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的人羰基還原酶基因共有4個，它們分別為CBRl、DCXR、CBR3和CBR4。我室1998年利用同源克隆策

2、略得到其中的DCXR基因，GenBank登錄號為AFl39841，本文主要是對CBRl和DCXR基因編碼蛋白的功能及其可能的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行分析。 本研究首先檢查了這兩個基因的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，人體16種組織的CBRI和DCXR基因在肝臟中的表達(dá)量明顯高于其它各組織，尤其是DCXR基因在肝臟中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它各組織，這可能與肝臟的解毒功能有關(guān)。然而，34對肝癌和癌旁組織的NorthemBlot、RT-PCR及免疫組織化學(xué)

3、檢測結(jié)果卻顯示，CBRl和DCXR基因在肝癌組織中的的表達(dá)水平顯著低于正常對照，這間接反映出肝組織癌變時解毒功能受到嚴(yán)重?fù)p害，也可能反映了肝癌的發(fā)病機制與肝臟解毒功能有某種關(guān)聯(lián)。 我們對原核表達(dá)的重組CBRl和DCXR蛋白進(jìn)行了還原酶活性分析，發(fā)現(xiàn)它們都能特異性地還原典型的醌類底物9，10一菲醌和醛酮類底物吲哚滿二酮，具有羰基還原酶活性。當(dāng)酶促反應(yīng)體系pH值為6．2左右時，酶催化底物的活性最強，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報道相一致。為了判斷

4、它們在肝癌中顯著下調(diào)表達(dá)的特征是否可用于指導(dǎo)臨床用藥，我們分析了這二種酶對17種抗癌藥物的代謝能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CBRl和DCXR能特異性地代謝抗癌藥物長春新堿(VCR)，沙爾威辛(SALVICIN)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。 然而，盡管CBRl對EGCG顯示脫氫酶活性，但對于僅在B環(huán)結(jié)構(gòu)上與EGCG分子存在差異的表兒茶素沒食子酸酯(ECG)分子，我們卻檢測不到這種脫氫酶活性，據(jù)此我們推測CBRl催化EGCG的部位可

5、能是B環(huán)焦酚型結(jié)構(gòu)。應(yīng)用EGCG進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)藥物濃度達(dá)到20ug/ml時，轉(zhuǎn)染了CBRl基因的SK-HEP．1實驗組細(xì)胞凋亡發(fā)生的比例(3．40％)明顯低于僅轉(zhuǎn)入了空載體的SK-HEP．1對照組細(xì)胞(15．52％)(p<0．01)。阻滯在G1期的細(xì)胞也是實驗組(60．42％)少于對照組(72．63％)(p<0．01)。提示CBR，基因的表達(dá)產(chǎn)物具有拮抗EGCG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯的作用。

6、細(xì)胞毒性實驗證實，在30ug／ml濃度EGCG藥物作用下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CBR1基因的肝癌細(xì)胞SK—HEP．1(25％)對EGCG的耐受性是轉(zhuǎn)染了空載體的對照組細(xì)胞(9．1％)的2．7倍(p<0．05)，但是對5一氟尿嘧啶的耐受性未發(fā)生明顯變化(p>0．05)，提示細(xì)胞對EGCG藥物敏感性的降低與CBRl基因的隨機插入無關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)在50ug/ml濃度EGCG藥物作用時，CBRl表達(dá)量較高的肝癌細(xì)胞株HepG2(51．98％)對EGCG

7、的耐受性顯著高于CBRI表達(dá)量較低的肝癌細(xì)胞株Hep-3B(21．82％)(p<0．05)。提示EGCG特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(而不影響正常細(xì)胞)的表觀性狀可能與在正常成人肝組織中大量表達(dá)而在肝癌組織中下調(diào)表達(dá)的CBRl蛋白對EGCG的滅活作用有關(guān)，這對臨床用藥可能具有重要的指導(dǎo)意義。 進(jìn)一步的研究還顯示，在肝癌細(xì)胞株FOCUS中穩(wěn)定表達(dá)DCXR蛋白能使細(xì)胞對DNR和VCR的敏感性顯著降低(p<0．05)。在人宮頸癌細(xì)胞Hela

8、中穩(wěn)定表達(dá)DCXR蛋白也能使細(xì)胞對這兩種藥物的敏感性降低(p<0．05)。DCXR蛋白能在臨床劑量范圍內(nèi)拮抗常用抗癌藥物柔紅霉素和長春新堿的毒性的實驗結(jié)果提示，DCXR蛋白可作為研究醛酮類抗腫瘤藥物藥效的一種新的標(biāo)志物。 我們的這項研究表明，CBRl和DCXR是兩種在肝臟中高豐度表達(dá)的解毒蛋白，它們在肝細(xì)胞發(fā)生癌變時表達(dá)銳減。它們的代謝底物雖然都是含羰基的醛酮類及醌類化合物，但對各種具有上述結(jié)構(gòu)的抗癌藥物的底物特異性卻存在較大差