界面自組裝羰基還原酶不對(duì)稱還原3--羰基--3--苯基丙酸乙酯制備(R)--3--羥基--3--苯基丙酸乙酯.pdf

1、(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯是(R)．托莫西汀的關(guān)鍵手性中間體。托莫西汀(Atomoxetine)是一種選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑。2002年2月，該藥成為第一個(gè)獲美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)的非中樞興奮藥物。
　　采用實(shí)驗(yàn)室保藏菌種熱帶假絲酵母Candida tropicalis CGMCC NO.15016作為催化劑，以3-羰基-3-苯基丙酸乙酯為底物，生物法不對(duì)稱還原合成(

2、R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯。以磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系作為生物催化反應(yīng)介質(zhì)，采用二硝基水楊酸(DNS)法研究有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的耐受機(jī)制，采用氣相色譜分析法確定最佳反應(yīng)體系為:在磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯（相體積比1∶1）兩相體系中，以8％添加量的乙醇作為輔助底物，菌體濃度為30g/L（菌體干重/反應(yīng)液體積），磷酸鹽緩沖液pH6.0，36℃，120r/min的條件下反應(yīng)48h?？蓪?.050mol/L的3-羰基-3-苯基丙酸

3、乙酯轉(zhuǎn)化為(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯，底物轉(zhuǎn)化率及(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯對(duì)映體過(guò)剩值均可達(dá)到100％。
　　為了進(jìn)一步提高底物利用率，分離純化熱帶假絲酵母Candida tropicalis CGMCC NO.15016細(xì)胞內(nèi)的羰基還原酶。在甲苯/Tris-HCl緩沖溶液兩相體系中，將0.8g/L的羰基還原酶(180U/mg)與5.00g/L的聚苯乙烯相結(jié)合，得到界面自組裝羰基還原酶(155U/mg)。以界面自

4、組裝羰基還原酶為生物催化劑，不對(duì)稱還原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯。通過(guò)優(yōu)化界面自主裝酶在兩相體系的轉(zhuǎn)化條件，最終確定最優(yōu)反應(yīng)體系:在Tris-HCl/甲苯(相體積比10∶12.5)兩相體系中，以10％乙醇作為輔助底物，加入0.10mol/LNADH，35℃，140r/min的條件下反應(yīng)8h。可將0.056mol/L的3-羰基-3-苯基丙酸乙酯轉(zhuǎn)化為(R)．3．羥基-3-苯基丙酸乙酯，底物轉(zhuǎn)化率及(R

5、)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯對(duì)映體過(guò)剩值均可達(dá)到100％。
　　深入研究了界面自組裝酶在Tris-HCl/甲苯(相體積比10∶12.5)兩相體系中催化3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的不對(duì)稱還原制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)催化反應(yīng)中產(chǎn)物和底物濃度變化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，擬合動(dòng)力學(xué)方程，得到該反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為:Vm=3×10-3moL·L-1·h-1,KB=9×10-3moL·L-1·h-1,KA=7×10-6