醛酮還原酶AKR1C2原核表達(dá)及其應(yīng)用.pdf

1、醛酮還原酶AKR1C2是一種腫瘤基因相關(guān)蛋白，正常組織含量極少，當(dāng)癌癥發(fā)生時(shí)，AKR1C2含量升高，因此醛酮還原酶AKR1C2在生物體內(nèi)的表達(dá)、超表達(dá)，可作為長(zhǎng)期反應(yīng)癌癥發(fā)展水平的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，是監(jiān)測(cè)癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要指標(biāo)。通過免疫學(xué)手段，建立起的針對(duì)醛酮還原酶AKR1C2的檢測(cè)方法，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供了新的研究方向。
　　本文利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)醛酮還原酶AKR1C2基因。構(gòu)建表達(dá)載體pET-15b-AKR1C2并轉(zhuǎn)化

2、至大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞。之后對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)一條大約37kD條帶。優(yōu)化可溶性目的蛋白表達(dá)條件，選擇誘導(dǎo)時(shí)間10 h、誘導(dǎo)溫度20℃、誘導(dǎo)劑濃度0.8 mM、轉(zhuǎn)接量1:30作為最適蛋白表達(dá)條件，蛋白含量由未經(jīng)優(yōu)化前的5.45 mg/mL提高到9.50 mg/mL。優(yōu)化作用明顯，提高了可溶性目的蛋白表達(dá)量。在最優(yōu)表達(dá)條件下表達(dá)蛋白并進(jìn)行純化，得到目的蛋白單一條帶，雜蛋白被除去，純度在98

3、％以上。用獲得目的蛋白分別免疫新西蘭大耳兔和BALB/c小鼠，獲取兔源和鼠源的AKR1C2抗體，測(cè)定效價(jià)約為1:60000,并建立雙抗夾心的AKR1C2測(cè)定方法。通過對(duì)其酶活力進(jìn)行測(cè)定，醛酮還原酶AKR1C2對(duì)體內(nèi)激素類羰基化合物甲睪酮、孕酮的催化活性較低，對(duì)外源化合物苯甲醛、對(duì)苯醌有中等的催化活性，對(duì)丙二醛、丁烯醛、甘油醛有較高的催化活性。選擇甘油醛作為 AKR1C2最適底物，摸索最佳催化條件，當(dāng)酶含量為0.5 mg，底物濃度為1.0