2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、肝素(heparin)是由糖醛酸和D-葡萄糖胺組成的線性硫酸化多糖,具有抗凝血、調(diào)血脂等重要的生物學功能,具有廣泛的醫(yī)學臨床應(yīng)用。為解決傳統(tǒng)的動物源肝素在原料收集和生產(chǎn)環(huán)節(jié)中易受污染的問題,滿足全球市場對多類型肝素的巨大需求,開發(fā)非動物源肝素系列產(chǎn)品將對肝素的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用具有重要意義。
  非動物來源肝素主要有兩種制備途徑:一是以大腸桿菌K5發(fā)酵的肝素前體(heparosan)為底物,經(jīng)化學和酶法修飾得到生物工程肝素;二是

2、以二糖為起始底物經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺(或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺)為單糖供體逐個添加單糖得到七糖骨架,并經(jīng)化學和酶法修飾得到超低分子量肝素(Ultra-low molecular weight heparin,ULMWH)。但生產(chǎn)規(guī)模僅為毫克級別,距工業(yè)化生產(chǎn)還有很大的距離。主要的限制因素有1)肝素修飾酶硫磺基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine-5'-ph

3、osphosulfate,PAPS)價格昂貴且易分解,雖然酶法合成PAPS已經(jīng)實現(xiàn),但產(chǎn)量不高;2)肝素修飾酶的表達量低,很難大量獲得;3)目前肝素制備均采用純化后的游離酶進行反應(yīng),制備過程繁瑣,價格昂貴,且不能重復使用;4)ULMWH生產(chǎn)所需的單糖供體UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA價格昂貴,產(chǎn)量不高。為了解決以上問題,本文開展了以下方面的研究工作:
  本文重組表達了三磷酸腺苷硫化酶和5'-腺苷磷酰硫酸激酶,構(gòu)建了

4、一條體外高效合成PAPS的途徑。在最佳反應(yīng)條件下,采用三磷酸腺苷分批補料策略,PAPS產(chǎn)量可達10.32 g/L,轉(zhuǎn)化率為81.4%。
  通過密碼子優(yōu)化、與麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合表達以及表達條件優(yōu)化等策略,在大腸桿菌中表達了C5異構(gòu)化酶(C5 epimerase)、肝素2-O-磺基轉(zhuǎn)移酶(heparan sulfate2-O-sulfotransferase,2OST)、肝素

5、6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1(heparan sulfate6-O-sulfotransferase1,6OST1)、肝素6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶3(heparan sulfate6-O-sulfotransferase3,6OST3)和肝素3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1(heparan sulfate3-O-sulfotransferase1,3OST1)等酶法合成肝素關(guān)鍵酶,表達水平分別達到305、325、215、225和300 mg/L。
  進一

6、步研究了醛基化標簽固定肝素修飾酶的方法。通過蛋白理性設(shè)計,將醛基化標簽分別引入到MBP中的四處不同位置(E38H39,K170Y171,D209Y210和5352G353)。通過比較重組MBP表達量和對氨基樹脂的吸附能力,發(fā)現(xiàn)D209Y210(pMAl-mbp7-FGE)獲得最佳醛基化標簽引入位點的融合配體MBP。利用綠色熒光蛋白和精氨酸水解酶作為報告蛋白,證實氨基樹脂LX-1000HA對綠色熒光蛋白的結(jié)合率達90%,對精氨酸酶的結(jié)合率

7、達71%。該固定化方法極大地提高了精氨酸酶操作穩(wěn)定性,在使用14次之后仍保留了53%的活性。將該方法應(yīng)用于肝素修飾酶,高效制備了五種肝素修飾酶的固定化酶。
  利用固定化肝素修飾酶建立了合成肝素的工藝路線。肝素前體經(jīng)化學法脫乙?;?、加硫磺基后獲得N-硫磺化肝素前體(N-sulfo heparosan)。以自制PAPS為硫磺基供體,利用固定化酶C5 epimerase、2OST、6OST1和6OST3對N-sulfo heparos

8、an進行一鍋法硫磺化修飾,然后利用固定化酶3OST1對上述反應(yīng)物進一步硫磺化修飾得到生物工程肝素。經(jīng)3OST1修飾得到的生物工程肝素具有抗凝血活性,效價可達到1.4 IU。
  采用強陰離子交換(SAX)-高效液相色譜(HPLC)對肝素結(jié)構(gòu)進行分析,測定肝素經(jīng)酶法裂解后所得各種二糖的含量。根據(jù)定量分析,Heparosan中Ⅳ-A占100%,N-sulfoheparosan中Ⅳ-A占8.26%,Ⅳ-S占91.74%。而豬源的肝素中,

9、Ⅳ-A、Ⅳ-S、Ⅱ-A、Ⅲ-A、Ⅱ-S、Ⅲ-S、Ⅰ-A和Ⅰ-S所占的比例分別為1.98%、2.14%、3.65%、1.10%、10.44%、5.64%、0.76%和74.29%。這一工作為進一步生物合成肝素結(jié)構(gòu)鑒定奠定了基礎(chǔ)。
  最后,通過重組表達N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸水解酶,構(gòu)建了一條體外高效合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA的途徑。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,采用分批補料策

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