生物酶法催化瓦倫西亞烯生成圓柚酮的研究.pdf

1、倍半萜烯類化合物(sesquiterpene)及其衍生物廣泛分布于自然界中,是植物精油的重要組分之一,很多倍半萜化合物具有明顯的生物活性和應(yīng)用價(jià)值。圓柚酮((+)-nootkatone),屬于倍半萜化合物瓦倫西亞烯的酮類衍生物,具有獨(dú)特的芳香氣味,作為重要的香料原料在食品、日用品、化妝品以及煙草等等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用,具有很高的市場(chǎng)價(jià)值。
　　 圓柚酮在天然精柚中的含量很低,再加上其立體異構(gòu)體以及眾多萜烯類化合物的存在,一般很

2、難直接分離獲得,圓柚酮的天然提取路線不具有商業(yè)價(jià)值。目前,工業(yè)上常通過(guò)化學(xué)氧化價(jià)格相對(duì)便宜的瓦倫西亞烯((+)-valencene)來(lái)獲得圓柚酮,但在這過(guò)程中往往使用一些具毒性或污染性的氧化劑,對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害。近十幾年來(lái),采用生物技術(shù)催化瓦倫西亞烯生成圓柚酮已成為這一領(lǐng)域研究的新方向,特別是利用細(xì)胞色素P450BM-3(cytochrome P450BM-3,CYP450BM-3)對(duì)瓦倫西亞烯進(jìn)行氧化,已成為獲得圓柚酮的一條潛在途

3、徑。
　　 來(lái)源于巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的CYP450BM-3是CYP450家族當(dāng)中特殊的一員,因其亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移的FAD/FMN還原結(jié)構(gòu)域都包含在同一條肽鏈中,因此該酶在進(jìn)行催化時(shí)無(wú)需CYP450還原酶的輔助作用,這個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)使它具備了開(kāi)發(fā)成為工業(yè)用P450酶的潛力。以定點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR和體外同源重組技術(shù)(DNA shuffling)等等為代表的定向進(jìn)化技術(shù)已被用于對(duì)CYP4

4、50BM-3進(jìn)行改造,以期獲得對(duì)非天然底物具有良好催化活性的突變體。本文基于已有文獻(xiàn)報(bào)道,旨在尋找對(duì)瓦倫西亞烯具有更高催化效率和產(chǎn)物選擇性的CYP450BM-3突變體。
　　 本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)野生型CYP450BM-3基因進(jìn)行改造,獲得了R47L/Y51F/F87A和A74G/F87V/L188Q兩個(gè)突變體。將野生型和突變體基因分別連接入pET28a(+)中進(jìn)行重組表達(dá),利用純化的重組酶在體外對(duì)底物瓦倫西亞烯進(jìn)行催化。

5、氣相色譜被用來(lái)檢測(cè)各酶的催化產(chǎn)物,并分析、比較各突變酶與野生型CYP450BM-3對(duì)瓦倫西亞烯的催化活性。
　　 在體外,野生型CYP450BM-3-底物復(fù)合物對(duì)NADPH的催化速率為31±1.0 nmol(nmol P450)-1min-1,但產(chǎn)物中沒(méi)有檢測(cè)到圓柚酮生成;突變體R47L/Y51F/F87A對(duì)應(yīng)的這一氧化速率要高于前者,為79±6.5 nmol(nmol P450)-1min-1,并在其催化產(chǎn)物中檢測(cè)到圓柚酮的生

6、成,但圓柚酮含量?jī)H占總產(chǎn)物的6.8％；與此同時(shí),A74G/F87V/L188Q表現(xiàn)出與后者相當(dāng)?shù)拇呋?77±7.2 nmol(nmol P450)-1min-1),但產(chǎn)物中圓柚酮的含量更高,達(dá)8.0％。
　　 A74G/F87V/L188Q是本課題成功獲得的一個(gè)新的可以催化瓦倫西亞烯生成圓柚酮的CYP450BM-3突變體,表現(xiàn)出迄今為止最好的產(chǎn)物選擇性,同時(shí)兼具有較高的催化效率,但還未達(dá)到工業(yè)用酶的要求。在接下來(lái)的研究中,我