一種催化藥物合成中芳香烴硝化反應(yīng)生物酶的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、芳香烴的硝化是芳香族硝基化合物的制備中最為普遍的工藝過程，涉及大量重要化工原料的生產(chǎn)和制備，特別是在以藥物合成為代表的精細化工領(lǐng)域，對結(jié)構(gòu)選擇性的精確定點硝化更是有著迫切要求，比如著名的“生活方式(lifestyle)藥”西地那非核心中間體的來源即是通過芳香烴的硝化得以實現(xiàn)。芳香烴的硝化反應(yīng)工藝經(jīng)過漫長的優(yōu)化和進步過程，逐漸淘汰了濃硫酸參與的“混酸”方案，進而開發(fā)出一系列以催化劑為核心的液相或氣相硝化反應(yīng)，但是仍然始終無法擺脫硝酸的使用

2、，在副產(chǎn)物的控制、反應(yīng)的環(huán)境友好、原子經(jīng)濟性上均有很多亟待優(yōu)化和改進的問題。隨著生命科學(xué)的進步和合成生物學(xué)的興起，以生物酶實現(xiàn)重要工業(yè)反應(yīng)的綠色催化顯得越發(fā)誘人和富有前景。
　　細胞色素P450(Cytochrome P450，CYPs)是一種血紅素依賴型生物酶，能夠通過激活氧而催化多種氧化反應(yīng)。作為一類廣泛存在的酶家族，其功能涉及從哺乳動物體內(nèi)的脂代謝、藥物代謝，到植物體內(nèi)的三萜系化合物修飾，再到微生物體內(nèi)的生物合成和生物降解等

3、的諸多生理過程，其獨特的氧化催化能力使其自1958年被發(fā)現(xiàn)以來一直為學(xué)界所持續(xù)廣泛關(guān)注。CYPs不僅在有機體內(nèi)充當(dāng)著重要的分解代謝角色，其在自然界眾多天然產(chǎn)物的合成過程中同樣具有舉足輕重的地位。雖然一段時間以來人們對這方面的關(guān)注往往較少，甚至一定程度上可以說是為人們所忽視，但實際上這個領(lǐng)域才是讓CYPs真正大放異彩的“中央舞臺”。這其中涉及了大量非常引入入勝的化學(xué)反應(yīng)，其識別的底物更是往往具有令人驚嘆的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。在這一方面，CYPs表現(xiàn)

4、的完全不似其原來代謝角色的“包容”，而通常是只在特定的合成通路負責(zé)完成一個特定的合成工序，可想而知這意味著它們擁有十分特異的底物識別能力。
　　疥瘡鏈霉菌植物毒素薩克多敏生物合成路徑中重要的CYP酶TxtE(Thaxtomin E)能夠直接催化左旋色氨酸吲哚環(huán)的硝化，是近年鑒定的目前唯一一種可以以一氧化氮NO為原料直接實現(xiàn)芳香烴硝化的細胞色素P450家族生物酶。本文即以其為研究對象，力圖以結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段探究該酶底物識別和反應(yīng)催化的

5、分子過程。為進一步利用蛋白質(zhì)工程手段實現(xiàn)可能的分子改造和工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　本論文對TxtE酶進行異源重組表達、提純、結(jié)晶，利用同源建模和分子置換的方法成功解析了其三維晶體結(jié)構(gòu)，并在該工作基礎(chǔ)上對其底物識別特性進行了一定程度的探討。TxtE的三維結(jié)構(gòu)清晰地展示了一條底物進入活性位點的通道以及一條獨特的電子傳遞通道，隨后的工作初步判定了底物在活性中心的成鍵環(huán)境和結(jié)合形式。對TxtE的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和底物識別特性的探討，有助于未來