腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin調(diào)控shRNA腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)HepG-2細(xì)胞中CD133基因表達(dá)的抑制作用.pdf

1、目的;腫瘤特異性啟動(dòng)子Survivin調(diào)控shRNA真核表達(dá)載體腺病毒的構(gòu)建以及對(duì)HepG-2細(xì)胞中CD133基因表達(dá)的抑制作用。
　　方法;1、pEntry-SUR-GFP-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建;參考試劑盒說(shuō)明書(shū)提取HepG-2細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)GenBank(-222 to+39，GeneBank Accession NumberAY795969)提供的survivin啟動(dòng)子基因序列及pEntry載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)

2、sal1和NdeⅠ酶切位點(diǎn)（上下游引物序列）5-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC-3，下游引物序列5-GGAATTCCATATGGAATTCC-3擴(kuò)增片段為270BP將survivin啟動(dòng)子克隆到pEntry-EF1-GFP-shRNA上，以替換EF1啟動(dòng)子，構(gòu)建pEntry-Surp-GFP-shRNA真核表達(dá)載體。
　　2、pEntry-Surp-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染Hela.HepG-2293T細(xì)胞

3、株;RT-PCR檢測(cè)GFP證實(shí)GFP的表達(dá)由survivin驅(qū)動(dòng)，反應(yīng)引物上序列為5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3，下游引物序列為5-TTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTG-3，長(zhǎng)度200 bp，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱，證實(shí)survivin在HepG-2。Hela細(xì)胞株中有熒光，而293T細(xì)胞株中沒(méi)有熒光，且HepG-2細(xì)胞株表達(dá)高于Hela細(xì)胞，說(shuō)明survivin基因具有腫瘤特異性。
　　3、shRN

4、A CD133的設(shè)計(jì)，合成以及Ad.surp-GFP-shRNA的構(gòu)建和包裝:根據(jù)GenBank中CD133的核苷酸序列，參考Ambion公司設(shè)計(jì)shRNA的設(shè)原則，(1)設(shè)計(jì)3條干擾序GCTCAGAACTTCATCACAAAC2377),AAGCCAGAAACTGTAATCTTAG(485), ATGAGATTAAGTCCATGGCAAC(972),(2)通過(guò)Blast檢索確定三個(gè)干擾片段與人類(lèi)的其他基因不同源;shRNA的合成;將三

5、個(gè)干擾片段切成六個(gè)小的片段，送華大基因公司合成12條Oligo片段。紫外線(xiàn)分光光度計(jì)在260 nm波長(zhǎng)下定量，(3)切除pEntry-Surp-GFP-shRNA中的shRNA;連接目的基因;通過(guò)T4連接酶的作用，將合成好的shRNA927，shRNA485，shRNA2377分別連接到pEntry-Surp-GFP載體上。將構(gòu)建好的pEntry-Surp-GFP-shRNA通過(guò)gateway試劑盒重組腺病毒質(zhì)粒Ad.Surp-GFP-

6、shRNA，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，卡那霉素，LB平板，每個(gè)板挑選三個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定重組pAd-Surp-shRNA構(gòu)建成功，提取質(zhì)粒測(cè)量質(zhì)粒濃度為A260/A280=1.8032;A260/A280=t.8230; A260/A280=1.7104如圖1.1所示，送公司測(cè)序，結(jié)果正確。PacⅠ酶切后鑒定，重組子酶切顯示兩條切割帶分子量大小與酶切大小符合。通過(guò)gateway重組陽(yáng)性的 pAd.su

7、rp-GFP-shRNA972，pAd.surp-GFP-shRNA485，pAd.surp-GFP-shRNA2377質(zhì)粒在293A細(xì)胞中包裝Ad.Surp-GFP-shRNA，Ad.surp-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞，8d收集細(xì)胞，離心，2 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，反復(fù)凍融，離心收集上清液，此為低滴度的病毒原液Ad.Surp-shRNA，取50％病毒原液反復(fù)感染293A，13000 rpm離心收集上清，通過(guò)流

8、式計(jì)算可得到高滴度腺病毒通過(guò)公式計(jì)算為7.01x10(^)10 TU/ml。
　　4、含Survivin啟動(dòng)子重組的shRNA CD133基因重組的腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG-2體外作用的實(shí)驗(yàn)研究;含Survivin啟動(dòng)子的條件復(fù)制腺病毒Ad.surp-GFP-shRNA972，2377，485轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG-2感染293T細(xì)胞作為對(duì)比，應(yīng)用RT—PCR和Western blot檢測(cè)CD133mRNA和蛋白的表達(dá);MTT法

9、和Transwell法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖和侵襲能力，結(jié)果顯示，腺病毒972，2377，485能成功封閉CD133蛋白水平的表達(dá);972，2377組能成功敲低CD133 mRNA的表達(dá);MTT，Transwell檢測(cè)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和侵襲力都低于空白組，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與空白組相比mRNA抑制率分別為(63.44±0.02)％，（56.98±0.03）％;972組，2377組，485組蛋白抑制率分別為（55.43±0.4）％，(48.65

10、±0.2)％，（34.67±0.4）％;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖和侵襲能力也受到顯著抑制;972組抑制率為（72.88±0.74）％，2377組抑制率為(59.9±0.87)％，485組抑制率為（30.18±0.95）％。
　　結(jié)果:腫瘤特異性啟動(dòng)子Survivin調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的shRNA能顯著下調(diào)CD133基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞株HepG-2的增值和減弱其侵襲力。
　　結(jié)論:腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的sh