腺病毒載體左側(cè)ITR區(qū)對(duì)下游基因表達(dá)特異性的影響.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)今社會(huì)威脅人類(lèi)健康的主要疾病，腫瘤基因治療的迅速發(fā)展為攻克這類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的疾病帶來(lái)新的希望?；蜣D(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是基因治療過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在腫瘤的基因治療研究中，腺病毒載體目前應(yīng)用最多的一種病毒載體。研究表明，外源基因的高表達(dá)使得宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)增加，從而限制了腺病毒載體的功效。所以靶向感染腫瘤細(xì)胞的重組腺病毒逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。靶向轉(zhuǎn)運(yùn)是攻克這些問(wèn)題的一種重要策略，即在靶細(xì)胞中運(yùn)用腫瘤特異性啟動(dòng)子有選擇地表達(dá)特異性基

2、因。然而，一些具有高特異性和選擇性表達(dá)活性的啟動(dòng)子在克隆到腺病毒載體之后會(huì)被改變甚至缺失。對(duì)于這種現(xiàn)象，一種比較合理的解釋是腺病毒基因序列中，目的基因的附近存在著增強(qiáng)子或潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它們與啟動(dòng)子相互作用從而導(dǎo)致“非特異性”轉(zhuǎn)錄。目前報(bào)導(dǎo)的5型腺病毒基因組中含有增強(qiáng)子的元件有反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITR)，E2和E4啟動(dòng)子，pⅨ啟動(dòng)子和E1A增強(qiáng)子等。5型腺病毒基因組左側(cè)含有兩個(gè)增強(qiáng)

3、子元件，一個(gè)是重復(fù)序列，特異性調(diào)節(jié)E1A基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，另一個(gè)在重復(fù)序列即左側(cè)ITR之間，順式調(diào)節(jié)所有早期基因的轉(zhuǎn)錄，因此對(duì)下游基因的表達(dá)有著顯著影響。
　　 目的：構(gòu)建一系列含GFP報(bào)告基因的腺病毒載體，通過(guò)其熒光表達(dá)分析來(lái)研究腺病毒載體左側(cè)ITR區(qū)對(duì)下游基因表達(dá)特異性的影響。
　　 方法：采用一系列分子生物學(xué)方法及Gateway技術(shù)重組腺病毒載體左側(cè)ITR區(qū)下游構(gòu)建正反兩個(gè)方向含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟

4、動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子及GFP報(bào)告基因的重組腺病毒載體。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增出重組腺病毒顆粒，TCID50測(cè)得滴度后分別以相同的MOI感染不同的細(xì)胞，觀察熒光表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1)成功構(gòu)建了hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP五種重組腺病毒表達(dá)載體，并利用293A包裝系統(tǒng)制備了這五種高滴度的重組腺病毒。
　　 2)重組腺病毒分別感染2

5、93A細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞CNE、人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS、人乳腺癌細(xì)胞435S、人胰腺癌細(xì)胞Panel細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在293A細(xì)胞和Pancl細(xì)胞腺病毒的增殖效率較高，熒光表達(dá)較強(qiáng)。
　　 3)將各病毒在各細(xì)胞中的熒光表達(dá)量進(jìn)行分組。在各細(xì)胞中分別以CMV和rCMV為一組，hTERT和rhTERT為一組。發(fā)現(xiàn)，在各細(xì)胞中，各組總體間均有差異。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組內(nèi)熒光表達(dá)量不存在顯著差異。
　　 4)無(wú)啟動(dòng)子的重組腺病毒在腺病毒