甲胎蛋白特異性siRNA腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)人胃癌細(xì)胞株FU97的影響.pdf

1、目的： 采用腺病毒作為載體，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制AFP基因的表達(dá)，觀察其在AFP陽(yáng)性胃癌FU97中對(duì)甲胎蛋白基因的沉默作用，并研究抑制甲胎蛋白基因后對(duì)此腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響，由此我們可以研究甲胎蛋白在AFP相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其在AFP相關(guān)腫瘤的基因治療方面潛在的應(yīng)用價(jià)值。 方法： (1)選擇符合條件的AFP特異性RNA干涉靶序列，體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，與線性化的載體pDC316-EGFP-

2、U6質(zhì)粒連接； (2)構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox_El，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒； (3)成功包裝腺病毒Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA載體后，轉(zhuǎn)染入FU97細(xì)胞，篩選出最佳感染復(fù)數(shù)； (4)腺病毒干擾載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR、免疫發(fā)光、流式細(xì)胞技術(shù)和WesternBlotting觀察對(duì)AFP在mR

3、NA和蛋白水平的抑制作用； (5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)FU97細(xì)胞周期及凋亡的影響。 結(jié)果： (1)構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒載體經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序分析，證實(shí)與設(shè)計(jì)一致； (2)重組腺病毒Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA經(jīng)PCR檢測(cè)和EGFP表達(dá)證實(shí)構(gòu)建成功，并測(cè)滴度為6.8×109IU/ml； (3)篩選出最佳感染復(fù)數(shù)為：MOI=100; (4)RT-PCR、免疫發(fā)光和WesternBlotti

4、ng發(fā)現(xiàn)Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能顯著抑制AFP基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)； (5)流式細(xì)胞術(shù)周期分析顯示G0-G1期細(xì)胞百分率(33.49±1.85％)明顯低于空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組(64.76±2.98％和74.81±2.60％，P＜0.01)，G2-S期(64.10±2.59％)顯著高于空載體組和空白對(duì)照組(34.77±1.91％和29.85±2.85％，P＜0.01)；凋亡分析，實(shí)驗(yàn)組與各