肝細胞特異性丁型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)運載體的初步研究.pdf

1、丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,HDV)是迄今首先發(fā)現(xiàn)的具有共價閉合環(huán)狀負鏈RNA基因組的動物病毒。其毒粒直徑35～37nm,為大小介于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的Dane顆粒和其表面抗原HBsAg顆粒之間的球形顆粒。病毒顆粒外層由脂雙層和HBsAg組成,內(nèi)含由HDAg和HDV RNA基因組結(jié)合組成的核蛋白體。嗜肝性病毒的表面蛋白對HDV病毒侵入和新HDV病毒顆粒的裝配必不可少。

2、
　　 基因轉(zhuǎn)運載體能將基因或其它核酸物質(zhì)運載到細胞中,載體系統(tǒng)在生物技術(shù)中具有不可或缺的作用。根據(jù)載體的組成和制備過程可將基因轉(zhuǎn)運載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體是將外源基因包裝到天然病毒的外殼中,利用病毒對宿主細胞的感染將外源基因?qū)爰毎小Ｄ壳俺Ｓ玫牟《据d體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒載體等。用于基因治療的病毒載體的靶向性可以通過包膜蛋白上的靶向性結(jié)合分子和組織特異性啟動子的調(diào)控作

3、用來實現(xiàn)。
　　 HDV是一種特異性感染人及靈長類動物肝細胞的病毒,其生活周期需要HBV為其裝配成感染性病毒顆粒提供包膜蛋白;HBV大表面抗原L-HBsAg中PreS的延長部分包含有肝細胞特異性結(jié)合位點,故HDV和HBV都具有肝細胞的親嗜性。但是,HDV RNA的復(fù)制是在宿主細胞內(nèi)RNA聚合酶的催化下完成的,該過程并不需要HBV的存在。鑒于以上特性,HDV可以改造成一種靶向肝細胞轉(zhuǎn)運生物活性RNAs的特異性載體。有研究者采用57

4、nt的非HDV序列取代了棒狀結(jié)構(gòu)一端的13nt的HDV序列,結(jié)果改造后的病毒的復(fù)制效率為20％,證明了改造后的病毒可以作為轉(zhuǎn)運生物活性小RNA的載體工具。但是,將HDV改造成一種基因轉(zhuǎn)運載體工具還需大量的實驗研究。
　　 目的:
　　 篩選能夠穩(wěn)定表達L-HBsAg和S-HBsAg的細胞系,為HDV的體外裝配提供包膜系統(tǒng);構(gòu)建含HDV cDNA多聚體的真核表達載體,體外研究HDV基因組的復(fù)制及裝配,為肝細胞特異性丁型肝炎

5、病毒載體的構(gòu)建提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.包膜蛋白真核表達載體的構(gòu)建:以pGEMT-HBV為模板,PCR擴增編碼S-HBsAg和L-HBsAg的基因片段,然后連接到pGEM-T載體上,得到重組載體pGEMT-S和pGEMT-LS。利用ApaⅠ和NotⅠ分別酶切pGEMT-LS與pcDNA3.1(-)、pGEMT-S與pBSK,目的片段回收后利用T4連接酶連接后得到pcDNA3.1-LS和pBSK-S。利

6、用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切pBSK-S和pcDNA4/His MaxA,目的片段回收后利用T4連接酶連接得到重組載體pcDNA4-S,最后分別采用質(zhì)粒PCR和酶切驗證重組載體的正確性。
　　 2.穩(wěn)定細胞系的篩選:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3.1-LS轉(zhuǎn)入HepG2細胞,48小時后利用G418進行壓力篩選,陽性克隆經(jīng)細胞計數(shù)后以單細胞的形式移至96孔板內(nèi)擴大培養(yǎng),篩選得到的穩(wěn)定細胞系經(jīng)RT-PCR和SDS-PAGE檢測;p

7、cDNA4-S質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入經(jīng)鑒定后穩(wěn)定表達有L-HBsAg的HepG2細胞,采用Zeocin進行壓力篩選預(yù)期得到能夠同時穩(wěn)定表達L-HBsAg和S-HBsAg的穩(wěn)定HepG2細胞系。
　　 3.重組HDV真核表達載體的構(gòu)建:通過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切位點,pcDNA3.1-D2載體中的HDV二聯(lián)體的連接入pUC19克隆載體從而得到pUC19-D2;采用HindⅢSacⅠ雙酶切位點,pUC19-D2中的HDV二聯(lián)體分

8、別重組入pEGFP-N1和pEGFP-C1載體,得到含有EGFP標簽的重組載體pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2。
　　 4.HDV體外復(fù)制研究:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將重組HDV真核表達載體轉(zhuǎn)入293T細胞,通過熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的表達,收集轉(zhuǎn)染后細胞分別提取RNA和蛋白進行熒光定量PCR和EUSA檢測丁型肝炎病毒基因的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定重組

9、載體,pcDNA3.1-LS和pcDNA4-S重組真核表達載體構(gòu)建成功:
　　 2.pcDNA3.1-LS轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,利用900μg/ml的G418篩選14天后獲得了陽性細胞克隆,經(jīng)PCR以及SDS-PAGE鑒定的HepG2細胞穩(wěn)定表達有L-HBsAg。在此基礎(chǔ)上,利用800μg/ml的Zeocin篩選同時穩(wěn)定表達L-HBsAg和S-HBsAg的細胞系未獲成功;
　　 3.經(jīng)PCR和酶切鑒定重組載體,證明成功構(gòu)

10、建了同時表達有HDV二聯(lián)體以及EGFP標簽的pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2重組載體;
　　 4.攜帶EGFP標簽的重組HDV載體在293T細胞中能夠表達EGFP,但強度較pEGFP-N1對照組要弱;pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2轉(zhuǎn)染293T細胞后能夠在體外起始HDV基因組的復(fù)制。經(jīng)熒光定量PCR分析目的基因的表達量為105copies/μl,其水平與pSVL-D3和pcDNA3.1-D2相當(dāng);但是

11、對HDAg的ELISA分析顯示細胞內(nèi)HDAg的表達量較低。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)實驗研究證實,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法獲得了穩(wěn)定表達有HBV L-HBsAg的HepG2細胞系,但是同時利用兩種抗生素進行穩(wěn)定細胞系的篩選還需進一步優(yōu)化實驗方案來驗證。
　　 本實驗成功構(gòu)建了含有EGFP的重組HDV真核表達載體,并利用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)入293T細胞,通過觀察綠色熒光、熒光定量PCR和ELISA檢測等方法分析證實了重