丙型肝炎病毒基因組變異與肝細胞癌的相關性研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等慢性肝病的主要病原體之一。HCV感染呈全球性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,目前世界上感染率約為3％,全球估計有超過1.7億的慢性HCV感染者,每年新發(fā)病例約350萬例,是歐美及日本等已發(fā)展國家中晚期肝病的主要原因之一。我國HCV發(fā)病情況也呈逐年上升趨勢。HCV感染已成為世界性的最重要的公共

2、健康問題。臨床上,HCV感染有兩個顯著特點,其一為高度的慢性化,急性感染者中有50％-80％發(fā)展為慢性肝炎；其二為廣泛的疾病譜,多數(shù)患者只表現(xiàn)為輕微的肝損傷,而有大約20％的病人會發(fā)展為肝硬化,其中30％-50％的肝硬化患者最終可能會發(fā)展為HCC。
　　 HCV為有包膜的單股正鏈RNA病毒,在分類學上屬于黃病毒科(Flaviviridae),丙型肝炎病毒屬。其RNA基因組全長約9.4-9.6 kb。由三個連續(xù)部分組成:5’端的非

3、翻譯區(qū)(5’-untranslated regions,5’UTR)、單一的大開放閱讀框(open reading frame,ORF)和3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)。而ORF編碼一大小約3010-3033個氨基酸的多蛋白前體?；蚪M高度變異是HCV的一個基本生物學特性。依據(jù)其核酸序列的相似性,HCV至少可分為6個基因型和100多個基因亞型。并且在單一病毒株感染患者體內形成準種結構。病毒的變異與其致病性經(jīng)常是密切相關的,例如人類乳突病毒

4、有130個型別,但與子宮頸癌相關的主要是16與18型。是以自HCV發(fā)現(xiàn)以來,其病毒變異與疾病的相關性,特別是與HCC的相關性,一直是HCV研究領域的一個熱點。但到目前為止,仍沒有一個明確的結論。這主要與下列因素有關。一是許多研究的樣本數(shù)太小,所導致的結論不具備實質的統(tǒng)計學意義；二是HCC本身是一個多因素作用的結果,在研究病毒變異的作用時,其他因素沒有能夠很好地控制；三是檢測病毒變異的方法不一,有些研究使用凝膠阻滯分析,使得各研究之間的數(shù)

5、據(jù)闡釋存在困難。
　　 鑒于上述因素,在探求HCV基因變異與HCC相關性的大前提下,本課題在研究上設計了包含三個相對獨立的實驗,即(1)3’UTR變異與HCC的相關性；(2)在縱向分子流行病學框架下HCV株以及核心區(qū)基因變異與HCC的相關性；(3)在轉基因鼠模型上觀察HCV Core變異對HCC的誘導作用。這些實驗的結果一方面彌補了以往同類研究的遺漏與不足,另一方面對HCC的致癌過程提供了新的闡釋。同時,實驗中所建立的分子生物學

6、技術及基因分析流程對HCV研究,乃至對其他RNA病毒研究,具有重要的方法學意義。
　　 試驗目的:通過從病人血清中直接測定HCV完整的3’UTR,檢測HCV3’UTR的變異與HCC的相關性。
　　 試驗方法:
　　 1.建立從病人血清中直接測定HCV完整3’UTR的優(yōu)化實驗方案。
　　 2.將此方案直接用于HCC及對照組病人HCV3’UTR的檢測。
　　 3.統(tǒng)計學方法分析HCV3’UTR是否存在

7、變異及其與HCC的相關性。
　　 結果:
　　 1.評估了5個DNA聚合酶從HCVcDNA質粒中擴增3’UTR poly(T／TG)結構域的能力。其中聚合酶rTth XL、AmpliTaq和DyNAzyme可以用于隨后的優(yōu)化RT-PCR方案。
　　 2.用部分重疊法設定RT-PCR的引物區(qū)域,以避免由于病毒3’UTR高度結構所導致的DNA聚合酶的滑翔效應。
　　 3.優(yōu)化快速擴增cDNA末端(RACE)方

8、法以測定HCV完整3’UTR的極尾區(qū)域。
　　 4.優(yōu)化方案:兩步法測定完整的HCV完整3’UTR。從NS5B到3'X結構的中央部分作為第1個區(qū)域用RT-PCR擴增檢測,包含3'X結構的第二個區(qū)域用RACE方法檢測。
　　 5.直接用于測定HCC及對照組病人(各20例)埃及HCV4a基因型3'UTR,統(tǒng)計分析未發(fā)現(xiàn)3’UTR變異與HCC之間存在相關性.
　　 結論:
　　 1、建立了直接從病人微量血清測定

9、全長HCV3’UTR的方法,這一方法不僅對HCV研究具有相當?shù)闹匾?對其他用常規(guī)方法不能測定3’UTR的RNA模板,具有普遍的適用性。
　　 2、HCV3’UTR變異主要體現(xiàn)在其均聚區(qū)的長度變化而不是核苷酸組成成分的改變,與我們通常所說的基因變異概念上有很大差別。
　　 3、埃及流行的HCV4a3’UTR同樣呈現(xiàn)長度變異,但此變異與HCC的發(fā)生之間無相關性存在。
　　 實驗目的:探討埃及流行的HCV4a基因型中

10、是否存在與HCC相關的變異位點或特異性病毒株。
　　 實驗方法:
　　 1.數(shù)據(jù)收集:應用具有明確采樣模式和日期的三組HCV序列數(shù)據(jù),包括健康攜帶者、肝硬化和HCC患者。
　　 2.針對這三組數(shù)據(jù)的重疊區(qū)域,即丙型肝炎約387-bp處的Core(Core)及第一膜區(qū)基因(E1)區(qū)域,應用分子進化遺傳分析軟件包(MEGA)分析其基因變異頻率,變異模式及與HCC的相關性。
　　 3.分析以疾病為基礎的病毒群體

11、進化壓力及趨勢。
　　 結果:
　　 1.應用不同引物擴增HCVCore／E1區(qū)域,不導致顯著的序列錯誤。
　　 2.異質性模板能夠誘發(fā)DNA聚合酶的擴增錯誤。
　　 3.埃及流行的HCV4a基因型中無時間或疾病依賴的特異性HCV變異或病毒株的存在。
　　 結論:
　　 1、無論是在HCC還是在肝硬化的形成過程中,埃及流行的HCV4a Core／E1區(qū)中不存在特異性病毒變異位點,同時,以該

12、區(qū)域為基礎的種系分析未揭示HCC特異性病毒株的存在。
　　 2、HCV4a在埃及有長期的進化史且目前仍然處于進化活躍期。
　　 3、異質性模板所誘發(fā)聚合酶鏈反應(PCR)錯誤與終末期肝病患者丙型肝炎病毒所承受的強大進化壓力可導致偏離數(shù)據(jù)的產(chǎn)生與解讀。
　　 實驗目的:構建HCV Core轉基因小鼠模型,探討Core變異對HCV致癌潛能的影響。
　　 實驗方法:
　　 1.直接從HCC及肝硬化病人中

13、克隆HCV Core,通過基因分析確定轉基因實驗所需的病毒株。
　　 2.目標Core的核苷酸編碼優(yōu)化及人工合成。
　　 3.轉基因片段裝配,引入人脂蛋白調控序列。
　　 4.轉基因片段顯微注射產(chǎn)生轉基因小鼠。
　　 5.追蹤觀察。
　　 結果:
　　 1.結合臨床病例特征基因分析結果,選取病人H和病人P21的HCV Core成功構建轉基因小鼠。
　　 2.追蹤觀察實驗組H及P21