丙型肝炎病毒基因組3′非編碼區(qū)與細胞蛋白U2B作用的研究.pdf

1、本研究首先應(yīng)用T7噬菌體展示庫技術(shù)，以HCV3'NCR為誘餌篩檢T7噬菌體人肝細胞文庫，尋找與HCV3NCR相互作用并參與HCV基因復(fù)制的細胞蛋白。首先體外轉(zhuǎn)錄了來自HCV基因組全長的3'NCR，使之與生物素標(biāo)記的寡聚DNA退火結(jié)合，經(jīng)過三輪的重復(fù)篩選，最終獲得5個細胞蛋白，分別為剪接因子U2B、線粒體上的NADH脫氫酶亞單位3、細胞色素c氧化酶亞基Ⅱ、細胞色素P450超家族成員及一種功能未知的蛋白?！　』赗NA剪接因子可能與HCV

2、3'NCR相互作用、調(diào)節(jié)HCV復(fù)制的推測，本研究進一步探討了剪接因子U2B蛋白在HCV基因復(fù)制中的作用。通過構(gòu)建了針對U2B蛋白的RNA干擾重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)可特異、有效地抑制HCV亞基因組復(fù)制子細胞中內(nèi)源性U2B蛋白的表達。進一步通過定量RT-PCR和WesternBlot分別檢測U2B表達抑制后復(fù)制子細胞中HCV復(fù)制、翻譯的改變，發(fā)現(xiàn)HCV亞基因組復(fù)制子細胞中內(nèi)源性U2B蛋白的表達被抑制后，該細胞中HCV亞基因組的病毒RNA和蛋白質(zhì)水平

3、反而比對照組有顯著增加，提示U2B參與調(diào)節(jié)HCV的復(fù)制且對HCV的復(fù)制、翻譯有負調(diào)控作用。　　為了驗證核蛋白U2B在HCV復(fù)制子細胞中能定位于HCV復(fù)制發(fā)生的胞漿，進一步分離了復(fù)制子細胞的各亞細胞組分(包括HCV復(fù)制復(fù)合體所在的脂筏結(jié)構(gòu))，通過WesternBlot發(fā)現(xiàn)在HCV復(fù)制子細胞的胞漿及脂筏結(jié)構(gòu)中均有U2B的分布，說明U2B蛋白可以參與到HCV的復(fù)制過程，推測其可能是HCV復(fù)制復(fù)合體的組分之一。　　綜上所述，本研究應(yīng)用T7噬