反義RNA對(duì)丙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制作用研究.pdf

1、背景與目的：丙型肝炎病毒是一條有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于丙型肝炎病毒屬黃病毒科，是丙型肝炎的主要病原體。慢性感染常常演變成肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前尚無針對(duì)HCV的預(yù)防或治療性疫苗，較為認(rèn)可的治療方案是干擾素聯(lián)合應(yīng)用利巴韋林，但治療的病毒學(xué)應(yīng)答率僅在50％左右。因此，尋找更為安全有效的抗HCV治療方法已成為迫在眉睫的問題。HCV基因治療方法己成為近幾年來的研究熱點(diǎn)，分子技術(shù)如反義核酸以及RNA干擾技術(shù)在基礎(chǔ)和臨床研究方面己取得了一些進(jìn)

2、展。為探討反義核酸對(duì)HCV的作用，本研究構(gòu)建重組HCV復(fù)制子真核表達(dá)質(zhì)粒pHCV-EGFP并在Huh-7細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，再通過反義EGFP轉(zhuǎn)染觀察其對(duì)HCV復(fù)制的影響，為尋找新的抗HCV方法提供有效平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：(1)用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因替代HCV基因組中的包膜基因（E1和E2），體外構(gòu)建重組HCV復(fù)制子真核表達(dá)質(zhì)粒pHCV-EGFP,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和測序結(jié)果證明重組HCV復(fù)制子中未發(fā)生E

3、GFP和HCV編碼區(qū)讀碼框架改變。(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察和半定量RT-PCR方法證實(shí)該重組HCV復(fù)制子在Huh-7真核細(xì)胞中能有效復(fù)制并表達(dá)EGFP蛋白。(3)以人肝癌Huh-7細(xì)胞株為研究對(duì)象，脂質(zhì)體介導(dǎo)將pHCV-EGFP和反義EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)三組對(duì)照組：正義EGFP和HCV-EGFP復(fù)制子質(zhì)粒、HCV-EGFP復(fù)制子質(zhì)粒、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照，熒光顯微鏡和Wester

4、nblot檢測EGFP蛋白表達(dá)，半定量RT-PCR檢測HCVRNA的復(fù)制情況。
　　 結(jié)果：(1)酶切和測序證明正確構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒HCV-EGFP，并證實(shí)該質(zhì)粒能在Huh-7真核細(xì)胞中正確表達(dá)和有效復(fù)制。（2)反義EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的EGFP蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，HCVRNA的復(fù)制較對(duì)照組顯著減少(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了HCV-EGFP的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，并在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)，為在