反義RNA對丙型肝炎病毒基因表達的抑制作用研究.pdf

1、背景與目的：丙型肝炎病毒是一條有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于丙型肝炎病毒屬黃病毒科，是丙型肝炎的主要病原體。慢性感染常常演變成肝硬化和肝細胞癌。目前尚無針對HCV的預防或治療性疫苗，較為認可的治療方案是干擾素聯(lián)合應用利巴韋林，但治療的病毒學應答率僅在50％左右。因此，尋找更為安全有效的抗HCV治療方法已成為迫在眉睫的問題。HCV基因治療方法己成為近幾年來的研究熱點，分子技術如反義核酸以及RNA干擾技術在基礎和臨床研究方面己取得了一些進

2、展。為探討反義核酸對HCV的作用，本研究構(gòu)建重組HCV復制子真核表達質(zhì)粒pHCV-EGFP并在Huh-7細胞中復制表達，再通過反義EGFP轉(zhuǎn)染觀察其對HCV復制的影響，為尋找新的抗HCV方法提供有效平臺和實驗依據(jù)。
　　 方法：(1)用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因替代HCV基因組中的包膜基因（E1和E2），體外構(gòu)建重組HCV復制子真核表達質(zhì)粒pHCV-EGFP,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和測序結(jié)果證明重組HCV復制子中未發(fā)生E

3、GFP和HCV編碼區(qū)讀碼框架改變。(2)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系Huh-7細胞，熒光顯微鏡觀察和半定量RT-PCR方法證實該重組HCV復制子在Huh-7真核細胞中能有效復制并表達EGFP蛋白。(3)以人肝癌Huh-7細胞株為研究對象，脂質(zhì)體介導將pHCV-EGFP和反義EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh-7細胞，同時設三組對照組：正義EGFP和HCV-EGFP復制子質(zhì)粒、HCV-EGFP復制子質(zhì)粒、未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照，熒光顯微鏡和Wester

4、nblot檢測EGFP蛋白表達，半定量RT-PCR檢測HCVRNA的復制情況。
　　 結(jié)果：(1)酶切和測序證明正確構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒HCV-EGFP，并證實該質(zhì)粒能在Huh-7真核細胞中正確表達和有效復制。（2)反義EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的EGFP蛋白表達較對照組明顯下調(diào)，HCVRNA的復制較對照組顯著減少(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了HCV-EGFP的真核表達質(zhì)粒載體，并在Huh-7細胞中表達，為在