siRNA對MCF-7的VEGF基因表達的抑制作用.pdf

1、　　目的:用RNA干擾技術特異性抑制VEGF基因在乳腺癌細胞MCF-7的表達。 方法:體外轉錄合成針對VEGFmRNA的siRNA，使用脂質體轉染的方法導入細胞，觀察轉染后癌細胞的變化，MTT法檢測細胞存活率，RT-PCR檢測轉染后VEGFmRNA表達水平的變化，ELISA檢測蛋白表達的下降效果。 結論:應用RNA干擾技術可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，為腫瘤的基因治療提供了新思路。本文應用所設計的針對VEGF基因的兩組si

2、RNA，轉染在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的人乳腺癌細胞系MCF-7，結果顯示無論從細胞水平、mRNA水平還是蛋白水平，都對VEGF基因的表達發(fā)揮出明顯的抑制效果。從而得出在細胞水平上RNAi可成功應用于腫瘤的基因治療的結論，為其臨床應用提供理論基礎。同時提示我們在乳腺癌的抗血管生成基因治療中VEGF可以成為有效的靶位點。本文成功應用生物軟件所設計出來的兩個靶位點均能有效抑制VEGF蛋白的分泌、表達及人乳腺癌細胞系MCF-7細胞的增殖，為下一步動物試

3、驗打下良好的基礎。驗證了應用RNA干擾技術可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，為腫瘤的基因治療提供了新思路。siRNA能夠成功應用于體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系作為基因治療腫瘤的臨床前試驗，極有可能成為未來腫瘤基因治療的生物類新興藥物。實驗所用體外轉錄試劑盒所轉錄出來的siRNA純度高，可直接應用于體外培養(yǎng)細胞的轉染。脂質體轉染試劑脂質體2000轉染siRNA的效率比較高，可以基本滿足試驗需要。脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到RNA的磷酸骨架上以及

4、帶負電的細胞膜表面。帶負電的RNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成RNA-陽離子脂質體復合物。轉染時避免使用抗生素和血清以提高轉染效率。脂質體作為一種載體把siRNA帶入細胞內(nèi)，其與siRNA有個最佳質量比例，統(tǒng)計結果顯示質量比為1：1時效果最佳。文獻報道脂質體介導轉染法可以顯著提高細胞對反義寡核苷酸的攝入，當脂質體與寡核苷酸的質量比(ug/ug)為2：1時轉染效率最高。由于我們所用為雙鏈寡核苷酸，其分子量應該為反義寡核苷酸的兩倍，故質