反義c-myc對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因表達(dá)抑制作用的研究.pdf

1、目的：研究脂質(zhì)體LipfectAMINETM（LR）介導(dǎo)的c-myc反義寡核苷酸（ASODN）對(duì)MCF-7細(xì)胞端粒酶催化亞單位hTERT基因表達(dá)的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步闡明c-myc對(duì)hTERT基因的調(diào)控作用，并為針對(duì)端粒酶活性抑制的乳腺癌的基因治療提供理論依據(jù)。方法：培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長期時(shí)，根據(jù)所購脂質(zhì)體的廠家推薦劑量，按照每孔脂質(zhì)體200μl，寡核苷酸500μl的劑量配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入各孔細(xì)胞中。研究設(shè)

2、置對(duì)照組、LR-SODN組及LR-ASODN組，每組6個(gè)復(fù)孔。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，分別收集各組細(xì)胞，用UNIQ柱式TRIZOL提取法提取各組總RNA，按MMLV一步法PCR（略作改進(jìn)）進(jìn)行hTERT mRNA表達(dá)的檢測(cè)，紫外凝膠成像分析儀進(jìn)行凝膠電泳產(chǎn)物的灰度掃描，以hTERT與內(nèi)對(duì)照引物β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的比值表示hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，α=0.05。結(jié)果：1

3、. 1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠電泳分析RNA提取樣品顯示28S和18S兩條清晰帶，前者的質(zhì)量是后者的2倍，表明RNA提取成功，提取樣品可用作RT-PCR的擴(kuò)增模板。 2. RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示：各組在PUC Mix Marker 145bp處均可見明暗不一的hTERT擴(kuò)增條帶，于540bp處可見明暗一致的β-actin擴(kuò)增帶；3.凝膠灰度掃描以hTERT和內(nèi)參照引物β-actin的灰度比值表示hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)

4、量。對(duì)照組的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.705、 0.713、0.753、0.724和0.733；LR-SODN組24小時(shí)的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.704、0.714、0.750、0.724和0.731；48小時(shí)的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.703、0.713、0.747、0.726和0.730；72小時(shí)的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.699、0.716、0.742、0.

5、719和0.730；LR-ASODN組24小時(shí)的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.589、0.612、0.538、0.614和0.701；48小時(shí)的5組hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.289、0.218、0.274、0.265和0.254；72小時(shí)的5組hTERT mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.148、0.136、0.131、0.159和0.143。單因素方差分析顯示，LR-ASODN作用于MCF-7細(xì)胞24、48、7

6、2小時(shí)時(shí)hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別與LR-SODN、對(duì)照組相比有顯著性差異（P <0.01），LR-SODN作用于MCF-7細(xì)胞24、48、72小時(shí)時(shí)hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量分別與對(duì)照組相比無顯著性差異（P >0.05）。并且ASODN對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因的抑制效果隨時(shí)間推移而逐漸升高。結(jié)論：1. LR介導(dǎo)的c-myc ASODN能有效抑制MCF-7細(xì)胞中端粒酶hTERT mRNA表達(dá)水平，且抑制效果隨著時(shí)間的延

7、長逐漸明顯。本研究通過抑制hTERT的促進(jìn)因素—c-myc來改變hTERT活性，從逆向的角度進(jìn)一步證明c-myc對(duì)hTERT基因表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用；2. 結(jié)合繼往c-myc ASODN能有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長及其c-myc蛋白表達(dá)的研究結(jié)果，推測(cè)其機(jī)制為：LR介導(dǎo)c-myc ASODN通過封閉c-myc基因抑制其蛋白表達(dá)，下調(diào)hTERT基因表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)端粒酶活性，使細(xì)胞生長受到抑制。3. 通過c-myc反義寡核苷酸封閉c-my