納米載體介導(dǎo)的hTERT反義寡核苷酸對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用研究.pdf

1、食管癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，治療效果尚不理想，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，找到一種新的治療食管癌的方法成為可能。 端粒(telomere)是位于真核細(xì)胞線性染色體末端，由高度保守的簡(jiǎn)單重復(fù)的DNA序列和蛋白質(zhì)組成的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)于保護(hù)染色體、防止染色體融合、降解是非常重要的。端粒酶(telomerase)是一種核蛋白，由3種亞單位成分：即人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA，hTR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(h

2、umantelomerasereversetranscriptase，hTERT)和端粒酶相關(guān)蛋白I(telomeraseassociatedprotein，TPI)組成，近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)端粒酶是細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生必不可少的，是人體內(nèi)最具腫瘤特異性和高表達(dá)的生物學(xué)標(biāo)志。其中hTERT是端粒酶活性的表達(dá)亞基，它幾乎存在于所有的惡性腫瘤中，hTERT的表達(dá)與端粒酶活性相一致，是端粒酶活性的決定性因素。因此，hTERT成為靶向端粒酶抗癌策

3、略的理想靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，91％的食管癌組織中可檢測(cè)到端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。 反義核酸技術(shù)是一門全新的基因工程技術(shù)，近年來(lái)發(fā)展迅速。利用反義核酸技術(shù)，人工合成靶向hTERT的反義寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)，抑制hTERTmRNA表達(dá)和端粒酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前進(jìn)行腫瘤基因治療的方向之一。未經(jīng)修飾的寡核苷酸(Oligonucleotides，ODNs)易被胞內(nèi)

4、核酸酶降解，作用效果較差。研究者們利用各種不同的病毒或非病毒基因載體保護(hù)和攜帶ODNs，其中納米粒載體，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，受到廣泛關(guān)注，它能夠很好地解決反義核酸被核酸酶降解的問題，增加反義核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量，提高反義核酸在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，以確保其長(zhǎng)期的生物學(xué)效應(yīng)。 本研究制備了聚氰基丙烯酸丁酯納米粒(polybutylcyanoacrylatenanoparticles．PBCA-NPs)，并研究PBCA-NPs的細(xì)胞毒性及其介導(dǎo)

5、的ASODN的細(xì)胞攝入情況，為PBCA-NPs作為基因載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。觀察了hTERTASODN對(duì)EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的影響，探討ASODN體外對(duì)EC9706細(xì)胞抑制作用的機(jī)理，為食管癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.食管癌EC9706細(xì)胞，用含10％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI．1640培養(yǎng)基，于37℃、5％C02飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。 2.采用乳化聚合法制備PBCA

6、-NPs并采用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞毒性。 3.設(shè)計(jì)6條互補(bǔ)于hTERTmRNA不同基因位點(diǎn)的ASODN，2條互補(bǔ)于hTERTDNA不同基因位點(diǎn)的ASODN及一條正義寡核苷酸(senseoligodeoxynucleotides，SODN)。每條寡核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODNs)設(shè)計(jì)5種不同濃度，由PBCA-NPs介導(dǎo)轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞。 4．實(shí)驗(yàn)分五組： Cell對(duì)照組：RPMI-1

7、640+10％胎牛血清培養(yǎng)液 NPs組：RPMI-1640+lO％胎牛血清培養(yǎng)液加入PBCA-NPs溶液 SODN-NPs組：RPMI-1640+10％胎牛血清培養(yǎng)液加2X,SODN-NPs混合液 ASODN組：RPMI-1640+10％胎牛血清培養(yǎng)液加入ASODN溶液 ASODN-NPs組：RPMI-1640+10％胎牛血清培養(yǎng)液加A．ASODN(Ⅰ-Ⅷ)-NPs混合液 5.轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞7

8、2h，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)端粒酶hTERT蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；一步法RT-PCR檢測(cè)hTERTmRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.pH值為2．0，DEAE-Dextran：Dextran為2：3，總的濃度為1．2％，BCA的濃度為0．8％時(shí)制得的納米粒粒徑均勻，平均粒徑為90．2nm，zeta電位40．1mv。 2．濃度不超過(guò)2．0g·L-1的PBCA-NPs溶

9、液對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。 3．MTT法檢測(cè)結(jié)果：8條ASODN對(duì)細(xì)胞的增殖都有不同程度的抑制，該抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增高依次增強(qiáng)，與細(xì)胞對(duì)照組相比差異顯著(p<0．05)，單純PBCA-NPs、SODN-NPs和ASODN對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯的抑制作用(p>0．05)。 4．hTERT蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定：細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞為陽(yáng)性著色，胞核和胞漿著棕色顆粒；陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為陰性著色，胞核著藍(lán)色。 5

10、．RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：與Cell對(duì)照組相比，PBCA-NPs、SODN-NPs和ASODN組hTERTmRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化(p>0．05)，各ASODN-NPs轉(zhuǎn)染組hTERTmRNA的表達(dá)明顯下降(p<0．05)。 6．細(xì)胞凋亡情況：轉(zhuǎn)染72h后，與對(duì)照組相比，I、V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出現(xiàn)凋亡峰，凋亡率分別為：14．7％、11．0％、18．7％、35．4％、30．7％。 結(jié)論： 1.乳化

11、聚合法制備并進(jìn)行DEAE-Dcxtran修飾的PBCA-NPs，粒徑均勻，大小和表面電荷適當(dāng)，PBCA-NPs作為基因載體，濃度不超過(guò)2．0g·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。 2．反義寡核苷酸能有效抑制EC9706細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。 3．反義寡核苷酸封閉hTERT不同基因位點(diǎn)后，對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)不同，表明hTERT不同基因位點(diǎn)在端粒酶活性表達(dá)中所起的作用可能不同。 4．反義寡核苷