靶向載體介導hTERT反義寡核苷酸對人乳腺癌裸鼠的影響.pdf

1、乳腺癌是目前臨床中最常見的惡性腫瘤之一,在婦女惡性腫瘤中,其發(fā)病率居首位。近年來隨著分子生物學技術及免疫學技術的迅速發(fā)展,乳腺癌的基因治療已逐漸成為繼手術、放療、化療和內(nèi)分泌等傳統(tǒng)治療方法之后發(fā)展起來的一種新的治療手段。乳腺癌生物學特性復雜,惡性程度高,其發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、復雜的漸進過程,而端粒酶(telomerase)的激活是其中重要的一環(huán)。在近90％人腫瘤細胞中端粒酶呈高表達,而在絕大多數(shù)正常體細胞中端粒酶不表達,所以端

2、粒酶成為了公認的最重要的腫瘤標志物之一。人端粒酶的三種亞單位成分:人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相關蛋白Ⅰ(telomeraseassociated protein,TPI)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)當中,hTERT是端粒酶活性的限速亞單位,它對端粒酶的活性調(diào)控起著決定性作用,因而hTERT也成為了靶向端粒酶抗

3、癌策略的理想靶點。研究表明,利用靶向hTERT的反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)可抑制端粒酶活性及腫瘤細胞的生長、誘導細胞調(diào)亡。但是,未經(jīng)修飾的裸ASODN在體內(nèi)應用時極易被血液中的核酸酶降解,而無法發(fā)揮其作用。為此,國內(nèi)外研究者們嘗試利用各種病毒或非病毒基因載體來保護和攜帶寡核苷酸,以解決在體內(nèi)其容易被降解而不能穩(wěn)定存在的難題,增加進入細胞內(nèi)的反義核酸的量,提高其穩(wěn)定性,確保

4、其生物學效應。聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)是近年來興起的一種極具應用潛能的非病毒基因載體,它可以把ASODN縮合成納米級的顆粒狀物,極大地提高轉(zhuǎn)染效率。但是,PEI/ASODN納米粒在體內(nèi)應用時,會迅速地被單核吞噬細胞系統(tǒng)清除而降低轉(zhuǎn)染效率;此外PEI還具有一定的細胞毒性。脂質(zhì)體(liposome)具有無毒、無免疫原性、且具有組織相似性和相溶性等優(yōu)點,用脂質(zhì)體來包裹PEI/DNA壓縮體制成LPD(liposom

5、e-PEI/DNA)復合物,能更好地保護、屏蔽PEI/ASODN壓縮體。NGR(N:天冬酰氨酸,G:氨基乙酸,R:精氨酸)多肽序列可以與腫瘤新生血管受體CD13特異性結(jié)合,具有很強的腫瘤靶向性。本研究中采用的CNGRCK2HK3HK11多肽中的半胱氨酸(C)含有巰基(-SH),可以與LPD表面的馬來酰亞胺基團發(fā)生反應,從而達到靶向修飾的目的,得到具有腫瘤靶向功能的LPD復合物(NGR/LPD)來保護、靶向運載ASODN。
　　本研

6、究以hTERT為靶點,設計合成針對此靶點mRNA的反義寡核苷酸,制備了NGR修飾的脂質(zhì)體-聚陽離子-ASODN復合物(NGR/LPD),另外制備脂質(zhì)體-聚陽離子-ASODN復合物(LPD)、B-PEI/ASODN縮合體(PEI/ASODN)作為實驗對照,經(jīng)過尾緣靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi),觀察制劑在體內(nèi)對MCF-7細胞的hTERT基因、蛋白表達的影響、腫瘤細胞凋亡情況和相關凋亡蛋白的表達變化及對腫瘤細胞生長的影響。
　　方法:1.NG

7、R/LPD、PEI/ASODN、LPD復合物的制備。2.NGR/LPD相關性質(zhì)的考察。3.NGR/LPD復合物的體內(nèi)活性研究。BALB/c裸鼠皮下注射人乳腺癌細胞系MCF-7細胞懸液,建立人乳腺癌動物模型。3.1體內(nèi)藥物分布實驗,共分為4組,每組3只裸鼠。實驗組Ⅰ經(jīng)尾緣靜脈給予ASODN-FAM復合物200μl實驗組Ⅱ經(jīng)尾緣靜脈給予PEI/ASODN-FAM復合物200μl實驗組Ⅲ經(jīng)尾緣靜脈給予FAM標記LPD復合物200μl實驗組Ⅳ經(jīng)

8、尾緣靜脈給予FAM標記NGR/LPD復合物200μl分別于給藥后1、3、6小時后短頸處死裸鼠,立即取出肝、腎、肺、脾和瘤體組織,冰凍切片,激光共聚焦顯微鏡下觀察各組織的藥物分布情況。3.2抑瘤實驗分組,共分為9組,每組5只裸鼠?？瞻讓φ战M:經(jīng)尾緣靜脈給予生理鹽水200μl反義核酸組:經(jīng)尾緣靜脈給予ASODN溶液200μl正義NGR/LPD組:經(jīng)尾緣靜脈給予SODN制備的正義NGR/LPD混懸液200μlPEI/ASODN高劑量組:經(jīng)尾緣

9、靜脈給予PEI/ASODN混懸液200μlPEI/ASODN低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予PEI/ASODN混懸液100μlLPD高劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予LPD混懸液200μlLPD低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予LPD混懸液100μlNGR/LPD高劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予NGR/LPD混懸液200μlNGR/LPD低劑量組:經(jīng)尾緣靜脈給予NGR/LPD混懸液100μl各實驗組裸鼠隔天給藥一次,連續(xù)給藥三周。每三天測定瘤體大小一次,測定三周。計算移植

10、瘤的體積,繪制生長曲線。4.移植瘤組織、各臟器作常規(guī)病理切片,顯微鏡下觀察病理形態(tài)學改變。5.免疫組化技術檢測移植瘤hTERT蛋白以及凋亡相關蛋白Bcl-2,C-myc蛋白表達情況。6.采用半定量RT-PCR法檢測瘤組織hTERT mRNA的表達情況。7.采用TUNEL法原位檢測各組腫瘤細胞凋亡情況。8.統(tǒng)計學分析:實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,數(shù)據(jù)用(±s)表示,α=

11、0.05作為差別有顯著性的檢驗水準。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過一系列相關考察驗證,證實NGR/LPD是形態(tài)規(guī)整的近球形復合物,平均粒徑在178nm左右,平均zeta電位近中性;可長期穩(wěn)定存放;對ASODN的包裹效果好;具備NGR多肽的腫瘤靶向修飾。2.體內(nèi)分布實驗結(jié)果顯示:四種制劑經(jīng)靜脈注射進入體內(nèi)后都部分地被肝、腎、肺和脾等臟器攝取、截留,但在瘤體中的它們的分布情況則明顯不同:ASODN、PEI/ASODN和LPD組瘤體組織中僅能觀察

12、到微弱的熒光,而在NGR/LPD組裸鼠瘤體中的熒光強度則明顯強于前三組,而且注射后1、3、6小時三個時間點觀察其熒光強度在逐步增強,表明NGR/LPD復合物可以有效進入到瘤體組織,而且會不斷地向瘤體組織富集。3.移植瘤的生長情況觀察:藥物治療3周后,觀測NGR/LPD組的瘤體生長明顯受到抑制,與其它各組具有顯著差異。4.免疫組織化學結(jié)果:與生理鹽水組相比較,NGR/LPD組hTERT蛋白表達明顯降低(P<0.01,P<0.05),高、低

13、劑量組間存在明顯差異(P<0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/ASODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。LPD、PEI/ASODN縮合體組染色得分值雖然不同程度降低,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),ASODN和正義組與空白對照對比無明顯差異(P>0.05)。NGR/LPD高劑量組C-myc蛋白表達明顯升高(P<0.05)、Bcl-2表達則明顯降低(P<0.05),NGR/LPD低劑量組C-myc及Bcl-2蛋白表達變

14、化不明顯(P>0.05),NGR/LPD高、低劑量組間存在明顯差異(P<0.05),其余各組變化均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。5.各組瘤組織hTERT mRNA檢測結(jié)果:NGR/LPD組hTERT mRNA水平與生理鹽水組比較明顯降低(P<0.01,P<0.05),且高、低劑量組間比較有顯著性差異(P<0.05)。PEI/ASODN、LPD高劑量組灰度值有不同程度降低,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/A

15、SODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。ASODN和正義組與空白對照對比無明顯差異(P>0.05)。6.細胞凋亡率檢測結(jié)果:各對照組偶見或少見凋亡細胞,NGR/LPD復合物高劑量組和NGR/LPD低劑量組凋亡細胞明顯增多,凋亡指數(shù)明顯增多(P<0.01,P<0.05),NGR/LPD高劑量組可見TUNEL染色陽性細胞呈小片狀分布。NGR/LPD高、低劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。NGR/LPD與LPD、PEI/AS

16、ODN相同劑量組間比較有明顯差異(P<0.05)。LPD、PEI/ASODN縮合體組得分值有不同程度升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),ASODN和正義組與空白對照對比無明顯差異(P>0.05)。7.對瘤體組織HE染色進行鏡下觀察時發(fā)現(xiàn):對照組瘤細胞生長活躍,可見瘤巨細胞,散在有點、片狀壞死灶。實驗(NGR/LPD高劑量)組可見瘤細胞瘤細胞間質(zhì)纖維化較明顯,可見大片壞死灶。在對裸鼠各臟器HE染色進行鏡下觀察時發(fā)現(xiàn):PEI/ASODN高

17、劑量組部分裸鼠肺泡腔內(nèi)可見大量漿液滲出,肺泡隔變寬。PEI/ASODN低劑量組及其它各組未見異常。
　　結(jié)論:1.本研究制備的復合型腫瘤靶向脂質(zhì)復合物(NGR/LPD)具有粒徑小、均一、無毒,對ASODN包封效果好,能夠穩(wěn)定保存等特點。2.以hTERT為靶點人工合成的ASODN可特異地抑制hTERT mRNA的表達和端粒酶活性,誘導腫瘤細胞凋亡。3.NGR/LPD能夠隨著血液循環(huán)靶向運載ASODN到達靶組織腫瘤細胞內(nèi),可以有效抑制