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文檔簡介
1、背景與目的:惡性腫瘤對生命的最大威脅就是其具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。目前已經(jīng)證明腫瘤脈管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)和血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)是血管內(nèi)皮生長因子家族(VEGFs)中最重要的兩種因子。其中VEGF-A主要在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要作用。而VEGF-C能促進(jìn)腫瘤淋巴管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,且在腫瘤血管生成中與VEGF-A具有協(xié)同促進(jìn)效應(yīng)。我們以前的研究表明[1],VEGF-
2、A及VEGF-C在人乳腺癌組織中均呈高表達(dá)(85.7%、90.8%),VEGF-A及VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鑒于VEGF-A、VEGF-C在腫瘤間質(zhì)血管、淋巴管生成中具有協(xié)同促進(jìn)效應(yīng),是最重要的促進(jìn)腫瘤間質(zhì)脈管生成因子,因此,同時(shí)阻斷這兩種因子的表達(dá),可望更有效地抑制腫瘤血管和淋巴管的生成,從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。 反義脫氧寡核苷酸(ASODN)是人工合成的DNA片段,它與體內(nèi)某信使核糖核酸(mRNA)或脫氧核糖核
3、酸(DNA)具有互補(bǔ)序列,并能通過堿基配對與互補(bǔ)鏈雜交,從而阻斷基因表達(dá)。因ASODN具有高效、低毒、特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),已被逐漸開發(fā)成為一種新型的抗癌藥物,ASODN作為一種藥物真正走向臨床已為期不遠(yuǎn)。目前,國內(nèi)外尚未見到利用反義脫氧寡核苷酸技術(shù)同時(shí)拮抗乳腺癌中VEGFS功能的報(bào)道。應(yīng)用原位移植(OrthotopicTransplantation)方法建立的乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型移植成功率高,移植瘤生物學(xué)行為和藥物動(dòng)力學(xué)更接近
4、于人體的原發(fā)瘤。因此,此模型成為研究腫瘤脈管生成、腫瘤生長轉(zhuǎn)移及治療的一個(gè)很好材料。結(jié)合以上的研究背景,并根據(jù)VEGF家族成員具有部分結(jié)構(gòu)同源序列的特點(diǎn),我們應(yīng)用可同時(shí)封閉VEGF-A、VEGF-C基因表達(dá)的ASODN片段,通過體外實(shí)驗(yàn),觀察該片段對乳腺癌MCF-7細(xì)胞VEGF-A和VEGF-C基因表達(dá)的抑制作用;并在乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型中觀察其對脈管生成及對腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響;為開發(fā)同時(shí)封閉VEGF-A、VEGF-C基因表達(dá)的反義
5、藥物奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。 方法一、用脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)介導(dǎo)ASODN轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡觀察FITC熒光標(biāo)記的ASODN轉(zhuǎn)染率隨時(shí)間變化的情況。 二、1uM的ASODN、錯(cuò)義脫氧寡核苷酸(MSODN)和單純脂質(zhì)體分別與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)48h,四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)(MTT)法檢測MCF-7細(xì)胞生長情況。 三、1uMASODN與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)12、24、48、7
6、2h后,RT-PCR法檢測VEGF-A和VEGF-CmRNA的表達(dá)情況。 四、建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,設(shè)立對照組、錯(cuò)義組和反義組。 五、體內(nèi)觀察ASODN對裸鼠移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA(RT-PCR)及蛋白表達(dá)(免疫組化)的影響。 六、彩色多普勒能量圖(CDE)檢測裸鼠移植瘤內(nèi)血管豐度。 七、5'單腺苷酸酶-堿性磷酸酶(5'-Nase-ALPase)雙重酶組織化學(xué)法標(biāo)記微血管和微淋
7、巴管,并計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(LMVD)。 八、觀察ASODN對裸鼠移植瘤成瘤時(shí)間、生長速度、腫瘤體積、重量及對腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的影響。 結(jié)果一、LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞:1uMASODN轉(zhuǎn)染6h后轉(zhuǎn)染率可達(dá)86%,48h轉(zhuǎn)染率為29%。 二、反義組(1uM)作用48h可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長(P<0.01),而脂質(zhì)體和MSODN對MCF-7細(xì)胞生長無影響(
8、P>0.05)。 三、1uMASODN轉(zhuǎn)染12h,可見MCF-7細(xì)胞VEGF-A和VEGF-CmRNA表達(dá)下降幅度最大。此后,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長,作用效果逐漸減弱,至48h后,其抑制作用基本消失。 四、將乳腺癌MCF-7細(xì)胞原位移植到裸鼠乳腺脂肪墊,各組在接種MCF-7細(xì)胞后接種部位出現(xiàn)腫塊,接種成功率為100%,部分荷瘤鼠可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 五、ASODN能抑制裸鼠移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA及蛋白表
9、達(dá)(P<0.01);而MSODN對VEGF-A和VEGF-C表達(dá)無明顯抑制作用(P>0.05)。 六、CDE檢測結(jié)果顯示:對照組(83.3%)及錯(cuò)義組(75.0%)以Ⅱ型、Ⅲ型血流信號(hào)為主;而反義組CDE血流信號(hào)多為0型、Ⅰ型(共占66.7%)。 七、5'-Nase-ALPase雙重酶組織化學(xué)法示微血管呈藍(lán)色,微淋巴管呈棕色。計(jì)數(shù)MVD與LMVD,結(jié)果顯示:ASODN對血管和淋巴管生成均有抑制作用(P<0.05),而MS
10、ODN對血管和淋巴管生成均無明顯抑制作用(P>0.05)。 八、反義組腫瘤生長速度較對照組及錯(cuò)義組緩慢,且腫瘤重量和體積明顯低于對照組(P<0.05);另外,ASODN能從直接蔓延、淋巴道轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移及種植性轉(zhuǎn)移這幾方面抑制腫瘤的擴(kuò)散。 結(jié)論一、應(yīng)用同時(shí)封閉VEGF-A、VEGF-C基因表達(dá)的ASODN片段,體外實(shí)驗(yàn)證明該片段可顯著下調(diào)MCF-7細(xì)胞VEGF-A和VEGF-CmRNA的表達(dá);并在一定程度上抑制了MCF-
11、7細(xì)胞的增殖。 二、原位移植方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,移植成功率高,部分荷瘤鼠可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,移植瘤生物學(xué)行為接近于人類原發(fā)乳腺癌。 三、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),此ASODN片段同樣可顯著下調(diào)移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA及蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制移植瘤血管和淋巴管生成。 四、ASODN通過抑制移植瘤血管和淋巴管生成,達(dá)到了抑制腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的目的。該ASODN片段在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
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