反義寡核苷酸抑制LA-N-5細胞VEGF表達及生物效應(yīng)的研究.pdf

1、背景：神經(jīng)母細胞瘤是兒童最常見的顱外實體腫瘤，而新生血管的形成是實體瘤生長的關(guān)鍵。目前治療腫瘤的各種藥物主要是針對腫瘤細胞本身進行的，但惡性腫瘤生長的血管依賴性提示，通過抑制腫瘤新生血管的形成可以阻止腫瘤的生長。血管內(nèi)皮生長因子(vaSCHlar endothelial growth factor，VEGF)是高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂因子，可作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞增殖遷移及血管網(wǎng)的形成，增加血管通透性，從而成為目前抗血

2、管治療的重要靶向。文獻報道，VEGF在人神經(jīng)母細胞瘤及其細胞系中呈現(xiàn)高表達。ASODN技術(shù)是一種可以選擇性和特異性地阻斷目的基因表達的技術(shù)，是基因治療的重要組成部分。由于它設(shè)計容易、合成簡單、樣式多樣、具有高度的靶異性(通過堿基互補原理)、較強的局部性和針對性，因而可以設(shè)計針對VEGF基因的ASODN抑制其超量表達。 目的：研究VEGF ASODN轉(zhuǎn)染對神經(jīng)母細胞瘤LA-N-5細胞VEGF基因mRNA表達的影響以及對瘤細胞增殖、

3、分化的影響。 方法：1．采用CY-3紅色熒光標記的VEGF寡核苷酸確定 Lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)下VEGF寡核苷酸的轉(zhuǎn)染條件及轉(zhuǎn)染效率；2．運用Lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)的VEGF ASODN和SODN轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞LA-N-5，半定量RT-PCR檢測各組細胞VEGF165和VEGF12lmRNA轉(zhuǎn)染前后不同時間的表達變化；3．MTT法測定轉(zhuǎn)染后各組細胞的生長曲線及抑制率。實驗

4、分為 ASODN、 ASODN+Lipofectamine<'TM>2000、 SODN、 SODN+ Lipofectamine<"TM>2000、Lipofectamine<'TM>2000和control組共6組。 結(jié)果：1．寡核苷酸：Lipofectamine<'TM>2000體積比為2．5：1時轉(zhuǎn)染效率最高，可達73.94±5.62％(P<0.05)； 2．半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示在72小時VEGF165和VEG

5、F12lmRNA的表達ASODN組為0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組為0.275±0.035和0.165±0.017， ASODN組及ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組都能顯著抑制VEGFmRNA的表達， ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組抑制作用比ASODN組更強(P<0.05)；3．在轉(zhuǎn)染后0、12、24、36、

6、48、60、72小時用MTT法檢測瘤細胞增殖情況的變化， ASODN組和ASODN+Lipofectamine<'TM>2000組能顯著抑制細胞增殖，于第48小時抑制率最高，達39.92±2.74％及55.80±2.52％，且ASODN+ Lipofectamine<'TM>2000組對細胞增殖的抑制作用較ASODN組更為明顯(P<0.05)。SODN組、SODN+Lipofectamine<'TM>2000組和control組比較對L

7、A-N-5細胞增殖的影響無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：1．寡核苷酸與Lipofectamine<'TM>2000體積比在2.5：1時轉(zhuǎn)染效率可以達到73.94％。2．VEGF SODN不能抑制VEGF mRNA的表達，也不能抑制LA-N-5細胞的增殖和分化。3．VEGF ASODN可抑制神經(jīng)母細胞瘤LA-N-5細胞VEGF在mRNA水平的表達，且ASODN+Lipofectamine<'TM>2000的效果優(yōu)于ASODN，