TSC2反義寡核苷酸對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、結(jié)節(jié)硬化癥(tuberous sclerosis complex，TSC)是一種常染色體顯性遺傳病，是以多種器官的組織缺陷和錯(cuò)構(gòu)瘤為特征的系統(tǒng)性疾病，最常表現(xiàn)為腦、腎、心臟、眼、肺以及皮膚出現(xiàn)的良性錯(cuò)構(gòu)瘤，是由抑癌基因Tsc1(tuberous sclerosiscomplex1，Tsc1)或Tsc2(tuberous sclerosis complex2，Tsc2)突變所引起。Tsc1與Tsc2作為腫瘤抑制因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中

2、起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。生長(zhǎng)因子刺激的PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)磷酸化馬鈴薯球蛋白(tuberous sclerosiscomplex2，TSC2)調(diào)控下游效應(yīng)因子，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，TSC2可通過(guò)在大腦中大量存在的一種Ras同源物(Ras homologueenriched in brain，Rheb)來(lái)發(fā)揮對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein，mTOR)的功

3、能，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。TSC2將Rheb從結(jié)合GTP的活化狀態(tài)轉(zhuǎn)換為結(jié)合GDP的非活化狀態(tài)，達(dá)到抑制mTOR的活性。磷酸化的TSC2喪失了TSC1/TSC2復(fù)合物作為GAP對(duì)具有GTP酶活性Rheb的作用，從而導(dǎo)致Rheb-GTP的聚集，Rheb-GTP可有效激活mTOR，mTOR通過(guò)磷酸化抑制真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白(eukaryotic translation initiation factor4E-binding pr

4、otein，4E-BP)的活性，并激活核糖體S6蛋白激酶1(70 kDaribosomal protein S6 kinasel， S6K1)和核糖體S6蛋白激酶2(70 kDa ribosomalprotein S6 kinase2，S6K2)的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，增值和分化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　 近年來(lái)，有關(guān)mTOR信號(hào)通路及其通路中相關(guān)基因之間的相互作用，以及與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，其中包括AKT

5、/TSC1-TSC2/mTOR通路及其相關(guān)基因。研究表明，Tsc2突變導(dǎo)致的蛋白功能失調(diào)可引起AKT/TSC1-TSC2/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，導(dǎo)致非TSC疾病相關(guān)腫瘤的發(fā)生，如：膽囊癌、鼻咽癌、喉癌、直腸癌、肺腺癌、肺小細(xì)胞癌、膀胱癌等。但有關(guān)Tsc2腫瘤抑制基因在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 為了探討Tsc2基因的異常表達(dá)在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，本研究采用TSC2反義寡聚核苷酸(antisense

6、oligonucleotide，ASODN)處理食管癌EC9706細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞技術(shù)、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中TSC2及mTOR蛋白的表達(dá)；采用原位雜交、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中TSC2和mTORmRNA的表達(dá)。
　　 材料和方法
　　 1．人食管癌EC9706細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)

7、。
　　 2．TSC2 ASODN，TSC2正義寡聚核苷酸(sense oligonucleotide， SODN)及無(wú)關(guān)寡核苷酸(non oligonucleotide， N-ODN)的設(shè)計(jì)與合成。
　　 3．食管癌EC9706細(xì)胞的分組培養(yǎng)：采用終濃度分別為5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞24h、48h、72h;同時(shí)以終濃度為15μmol/L的TSC2 SO

8、DN、N-ODN及不轉(zhuǎn)染組分別作為正義對(duì)照組、無(wú)關(guān)對(duì)照組和正常對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)液）。
　　 4．采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　 5．采用流式細(xì)胞技術(shù)、TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　 6．采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中TSC2及mTOR蛋白的表達(dá)情況。
　　 7．采用原位雜交、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中TSC2和mTOR mRNA的表達(dá)情況。

9、　　 8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件分析，數(shù)據(jù)采用-x±s數(shù)據(jù)表示，進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT檢測(cè)細(xì)胞各組細(xì)胞增殖能力的比較
　　 與各對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組處理因素均對(duì)EC9706細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用(P均＜0.001)，各對(duì)照組間細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異（P均＞0.05）。該作用具有濃度及時(shí)間的依賴(lài)性，且不同濃度及不同時(shí)

10、間段各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。
　　 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的情況
　　 與正常對(duì)照組(G0/G1：62.11±4.72，S:17.22±1.11)、無(wú)關(guān)對(duì)照組(G0/G1:64.80±1.25，S：17.28±1.33)和正義對(duì)照組(G0/G1:66.75±2.78，S：18.65±1.34)相比，各實(shí)驗(yàn)組各期細(xì)胞數(shù)所占的比例有所不同，G0/G1期細(xì)胞所占比例減少，S期細(xì)胞所占比例增

11、加，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，TSC2 ASODN對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響具有濃度的依賴(lài)性，且不同濃度各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。
　　 3流式細(xì)胞儀及TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況
　　 兩種方法結(jié)果均顯示，濃度為5μmol/L組、10μmol/L組、15μmol/L組的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率分別為：4.27±0.28、3.04±0.26、1.96±0.08，

12、晚期凋亡率分別為：4.66±0.30、3.25±0.30、1.99±0.18。AI分別為13.11±0.13、9.31±0.29、4.38±0.43。與正常對(duì)照組(早期凋亡細(xì)胞：4.91±0.14％，晚期凋亡細(xì)胞：10.35±0.47％。AI:16.23±0.45％)、無(wú)關(guān)對(duì)照組(早期凋亡細(xì)胞：5.12±0.12％，晚期凋亡細(xì)胞：9.68±0.55％。AI:16.63±0.34％)和正義對(duì)照組(早期凋亡細(xì)胞：5.13±0.23％，晚期凋

13、亡細(xì)胞：9.77±0.54％。AI:16.46±0.43％)相比，均明顯減少，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。各凋亡率及AI值隨TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染濃度的增加而減少，各濃度之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。
　　 4免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot結(jié)果
　　 4.1各組細(xì)胞中TSC2蛋白的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比，TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染組(Fimmuocytochemis

14、try=574.30、732.06、2293.70，F(xiàn)Western blot=50.60、330.69、1221.28，P均＜0.001)細(xì)胞中TSC2蛋白的表達(dá)均有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，且均有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性(Fimmunocytochemistry=253.54、270.00、269.64,FWesternblot=123.47、83.59、13.29，P均＜0.001)，即隨著TSC2 ASODN轉(zhuǎn)

15、染濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制TSC2蛋白表達(dá)的能力增強(qiáng)。
　　 4.2各組細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比，TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染組(Fimmunocytochemistry=1527.97、3543.79、1609.99，F(xiàn) Western blot=72.55、114.27、302.39，P均＜0.001)細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)均有所增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，且均有濃度依賴(lài)性和時(shí)

16、間依賴(lài)性(Fimmunocytochemistry=465.04、390.40、150.64，F(xiàn)Western blot=87.15、41.89、36.34，P均＜0.001)，即隨著TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，mTOR蛋白表達(dá)的能力逐漸增強(qiáng)。
　　 5原位雜交及RT-PCR結(jié)果
　　 5.1各組細(xì)胞中TSC2 mRNA的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比，TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染組(Fin-situ

17、 hybridization=67.81、139.61、392.57，F(xiàn)RT-PCR=1472.41、2733.14、656.62，P均＜0.001)細(xì)胞中TSC2 mRNA的表達(dá)均有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），且均有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性(Fin-situ hybridization=260.23,572.22,1004.35，F(xiàn)RT-PCR=53.56、260.40、333.24，P均＜0.001)，即隨著TSC2

18、 ASODN轉(zhuǎn)染濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制TSC2 mRNA表達(dá)的能力增強(qiáng)。
　　 5.2各組細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)
　　 與各對(duì)照組相比，TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染組(Fin-situ hybridization=381.78、772.79、1303.82，F(xiàn)RT-PCR=140.66、153.57、160.65，P均＜0.001)細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)均有所增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，

19、且均有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性((in-situ hyridiztion=1064.87、1334.50、2793.36，F(xiàn)RT-PCR=167.59、247.39、541.54，P均＜0.001)，即隨著TSC2 ASODN轉(zhuǎn)染濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，mTOR mRNA表達(dá)的能力逐漸增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 1．TSC2 ASODN可抑制細(xì)胞的凋亡，使S期細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞減少，促進(jìn)細(xì)胞的增值。