特異核基質(zhì)蛋白在人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡中作用的初步研究.pdf

1、本論文以姜黃素(curcumin，Cur)處理人食管癌EC9706細(xì)胞，在鑒定姜黃素對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果的基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析、免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等技術(shù)，對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡過(guò)程中核基質(zhì)蛋白的變化進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。分析鑒定和確證與EC9706細(xì)胞凋亡相關(guān)的特異核基質(zhì)蛋白，并研究特異核基質(zhì)蛋白與人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在細(xì)胞內(nèi)的共定位關(guān)系與變化，探索它們?cè)谌耸彻馨┘?xì)胞凋亡誘導(dǎo)過(guò)

2、程中的調(diào)控作用，以期能夠在較為整體水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)人食管癌細(xì)胞癌變與凋亡機(jī)理問(wèn)題，從而找出人食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶向性蛋白和深入探索的研究方向。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)30μmol/L姜黃素處理之后，EC9706細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)83.88％，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。光鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)姜黃素誘導(dǎo)處理后的EC9706細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞體積縮小、核質(zhì)比例減小、細(xì)胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)凝聚等顯著的細(xì)胞凋亡特征。瓊脂糖凝膠電

3、泳顯示EC9706細(xì)胞出現(xiàn)凋亡典型的DNA梯狀條帶。Hoechst染色顯示細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)姜黃素處理后，EC9706細(xì)胞內(nèi)的抑凋亡基因bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡基因bax、p53、fas等表達(dá)上調(diào)。雙向凝膠電泳與質(zhì)譜分析共鑒定12種蛋白，其中在凋亡的EC9706細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的有：Transcription elongation factor A(SII)-like4(TCEAL4

4、)、CCT8protein、Tara等3種核基質(zhì)蛋白；表達(dá)下調(diào)的有：Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin、Translation initiation factor eIF-2B subunit beta等9種核基質(zhì)蛋白。并進(jìn)一步通過(guò)蛋白免疫印跡確證了Nucleophosmin、Prollibin、HSP70、Spindling-2B、Vimentin等核基質(zhì)蛋白的變化。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示特異

5、核基質(zhì)蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B等與抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)均存在一定的共定位關(guān)系，并且它們的表達(dá)水平和細(xì)胞定位在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)前后均發(fā)生了改變。 研究結(jié)果表明，30μmol/L姜黃素對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡具有顯著誘導(dǎo)作用，并上調(diào)促凋亡基因bax、p53、fas的表達(dá)和下調(diào)抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)。在EC9706細(xì)胞凋亡過(guò)程中，

6、其核基質(zhì)蛋白組成產(chǎn)生了TCEAL4、CCT8 protein、Tara等3種蛋白表達(dá)上調(diào)和Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin等9種蛋白表達(dá)下調(diào)的明顯變化。其中，差異表達(dá)核基質(zhì)蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling2B與EC9706細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白均存在共定位關(guān)系，并在細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)移位和分布的改變。由此證實(shí)了與人食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的特異