siRNA對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞中Smo、Glil表達(dá)影響的研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點(diǎn),河南省是其高發(fā)省份。目前治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等,對(duì)中、晚期食管癌均有一定的局限性且療效不能令人滿意。因此,尋求食管癌生物治療的新靶點(diǎn)和新途徑已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。
　　 近年來,研究發(fā)現(xiàn)很多在胚胎發(fā)育、組織分化過程中起調(diào)控作用的信號(hào)通路同樣在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用,其中包括Sonic hedgehog信號(hào)通路、EGFR信號(hào)

2、通路、TGF-β信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。Smoothened(Smo)蛋白是Sonic hedgehog信號(hào)通路中的信息轉(zhuǎn)換器,能夠把細(xì)胞外的SHh信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Glil信號(hào),從而啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)Sonic hedgehog信號(hào)通路具有激活作用。正常組織和細(xì)胞中,Smo不表達(dá)或低表達(dá),維持細(xì)胞正常代謝需要。當(dāng)Smo過表達(dá)時(shí),可異常激活Hedgehog通路,產(chǎn)生大量促癌因子,使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變。研究表明,Smo在一些人

3、類腫瘤,如惡性膠質(zhì)瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、基底細(xì)胞癌等組織中高表達(dá)。有學(xué)者認(rèn)為,Smo有望成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)和早期診斷、評(píng)估預(yù)后的新指標(biāo)。
　　 Gli基因家族最初是在人類惡性膠質(zhì)瘤中擴(kuò)增Glil時(shí)被確認(rèn)的。人類有三種Gli同源基因:Gli1、Gli2、Gli3。Gli1基因編碼1106個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),定位于染色體12q13,作為脊椎動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)器,穿梭于細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間,將

4、轉(zhuǎn)錄信號(hào)由細(xì)胞漿傳遞進(jìn)細(xì)胞核。Gli1蛋白不能被蛋白酶所水解,只能以全長(zhǎng)的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),通過自身不同長(zhǎng)度對(duì)細(xì)胞核內(nèi)下游基因起轉(zhuǎn)錄或抑制作用,所以,Gli1蛋白只具有轉(zhuǎn)錄激活作用。另有研究表明,使用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞系中Smo表達(dá)的同時(shí)可降低Gli1的表達(dá)量。有關(guān)在食管癌中使用RNAi技術(shù)抑制Smo、Gli1表達(dá)的研究迄今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種在動(dòng)植物中

5、普遍存在的通過雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)在mRNA水平上誘導(dǎo)特異性序列基因沉默的過程。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后,在dsRNA核酸酶(Dicer)作用下,被裂解成21bp-23bp的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA與一種多聚核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silence complex,RISC),RISC同與siRNA互補(bǔ)

6、的mRNA結(jié)合,發(fā)揮RNA酶作用酶解mRNA,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的一種。目前應(yīng)用RNAi技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、抗病毒、抗腫瘤等領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究廣泛深入開展,標(biāo)志著RNAi必將成為研究基因功能不可或缺的工具。
　　 本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)特異性抑制食管癌EC9706細(xì)胞中Smo表達(dá),采用免疫細(xì)胞化學(xué)、原位雜交等技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EC9706細(xì)胞中Sm

7、o、Gli1蛋白及mRNA的表達(dá)情況,應(yīng)用Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲力的變化,為臨床應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向治療食管癌提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.人食管癌EC9706細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
　　 2.食管癌EC9706細(xì)胞的培養(yǎng):食管癌EC9706細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清,青霉素100U／ml,鏈霉素1

8、00U／ml),37℃、5％CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。
　　 3.siRNA的體外合成、鑒定及篩選:首先設(shè)計(jì)合成siRNA的寡核苷酸模板,5'端為T7啟動(dòng)子序列,在體外和T7 RNA聚合酶特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄出目的siRNA。分別合成兩段特異性siRNA和一段無義對(duì)照siRNA,應(yīng)用4％瓊脂糖凝膠電泳,以定量模板DNA為參照,測(cè)定siRNA的長(zhǎng)度和濃度；通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出一段干擾效果較好的特異性siRNA。
　　 4.轉(zhuǎn)染:應(yīng)用Li

9、pofusinX脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞。
　　 5.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中Smo和Gli1蛋白的表達(dá)情況。
　　 6.應(yīng)用細(xì)胞原位雜交技術(shù),檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中Smo和Gli1mRNA的表達(dá)情況。
　　 7.應(yīng)用Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲力的變化。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,

10、計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)；以α=0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功體外合成兩條siRNA,長(zhǎng)度均為21bp。
　　 2.EC9706細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:Smo特異性siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞后,可見細(xì)胞逐漸變圓,折光增強(qiáng),繼而開始皺縮,漂浮。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:150ng

11、／μl、200ng／μl、250ng／μl三種不同濃度的特異性Smo siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞24h、48h、72h后,Smo、Gli1蛋白表達(dá)量均有所降低,其中以250ng／μl轉(zhuǎn)染72h的抑制效應(yīng)最為明顯,各實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染)、空白對(duì)照組(空脂質(zhì)體)、無義對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義siRNA)相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；每個(gè)濃度組內(nèi)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加抑制效應(yīng)增強(qiáng),三個(gè)時(shí)間段兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

12、)；每個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨轉(zhuǎn)染劑量增加抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng),三種濃度兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組、無義對(duì)照組與細(xì)胞對(duì)照組相比均未表現(xiàn)出對(duì)Smo、Gli1蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng),三個(gè)對(duì)照組兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.原位雜交結(jié)果:150ng／μl、200ng／μl、250ng／μl三種不同濃度的特異性SmosiRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞24h、48h、72h后,Smo、Gli1 mRNA表達(dá)

13、量均有所降低,其中以250ng／μl轉(zhuǎn)染72h的抑制效應(yīng)最為明顯,各實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組、無義對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；每個(gè)濃度組內(nèi)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加抑制效應(yīng)增強(qiáng),三個(gè)時(shí)間段兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；每個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨轉(zhuǎn)染劑量增加抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng),三種濃度兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組與無義對(duì)照組相比均未表現(xiàn)出對(duì)Smo、Gli1 mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng),三個(gè)對(duì)照組

14、兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Smo siRNA體外轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞后,穿越Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯少于細(xì)胞、空白和無關(guān)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Smo siRNA可特異性抑制食管癌EC9706細(xì)胞中Smo蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 2.Smo siRNA在下調(diào)食管癌EC9706