己酮可可堿對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706中NF-κBp65、COX-2蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景和目的：食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)食管癌的死亡率居惡性腫瘤的第四位。氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)是食管癌的常規(guī)化療藥物,然而,化療耐藥仍是影響化療療效和患者預(yù)后的重要因素。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB),是一類(lèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子,主要形式為p50和p65組成的二聚體,p50是與DNA結(jié)合的部位,p65參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié),并可促進(jìn)p5

2、0與DNA結(jié)合,抑制其活性能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療的敏感性。COX-2的啟動(dòng)子含有兩個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn),NF-κB可以通過(guò)作用于這些結(jié)合位點(diǎn),調(diào)節(jié)COX-2基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)。Ki-67抗原為細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原,是一個(gè)反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)。己酮可可堿(pentoxifvlline,PTX),為磷酸二酯酶抑制劑,可以抑制IκBa的磷酸化及其降解,從而抑制NF-κB的活性。因此,PTX在腫瘤治療

3、中的作用已引起人們的廣泛關(guān)注。而PTX對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的直接作用和對(duì)NF-κB的表達(dá)影響,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用光學(xué)顯微鏡觀察,生長(zhǎng)曲線繪制,MTT測(cè)定分析PTX對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706的影響;并采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP法檢測(cè)PTX作用EC9706細(xì)胞24h后NF-κBp65及cox-2、ki-67蛋白的表達(dá)情況;采用光學(xué)顯微鏡觀察,MTT測(cè)定對(duì)比5-Fu和PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制作用,為尋找治療食管癌的新

4、方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法：人食管癌細(xì)胞株EC9706由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),引自河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞。將不同濃度的PTX作用于EC9706細(xì)胞,采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,生長(zhǎng)曲線繪制觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率;并采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP法檢測(cè)FFX作用EC9706細(xì)胞24h后NF-κBp65及COX-2、Ki-67蛋白的表達(dá)情況;將不同濃度的5-Fu

5、和PTX聯(lián)合5-Fu作用于EC9706細(xì)胞,采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,用MTF法對(duì)比檢測(cè)5-Fu和PTX聯(lián)合5-Fu對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞的抑制率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析(One-way ANOVA),t檢驗(yàn)。取a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.FTX作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察12~72h結(jié)果顯示,FTX0.01mg/ml處理組與對(duì)照組相似。PTX0.1mg/ml、0.5mg/ml

6、、1.0mg/ml組隨時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,但與對(duì)照組相比,隨濃度增加細(xì)胞增長(zhǎng)速度變慢,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散,胞質(zhì)渾濁。2.PTX作用后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示,各PTX處理組EC9706細(xì)胞的增殖受到一定程度抑制。各PTX處理組EC9706細(xì)胞數(shù)量仍是隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多,但與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并隨劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用越來(lái)越明顯。3.MIT法測(cè)量PTX作用于EC9706細(xì)胞的抑制率顯示,不同濃度的PTX(0.01~1.0

7、mg/ml)作用于EC970612h、24h、48h、72h,各組抑制率均數(shù)的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.745,P<0.05)。其中PTX0.01mg/ml組與對(duì)照組比較,48h后差異具有顯著性(P<0.05);PTX0.1、0.5、1.0mg/ml組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較,其差異均具有顯著性(P<0.05)。4.NF-κB P65蛋白在PTX作用EC9706細(xì)胞24h后,細(xì)胞陽(yáng)性率逐漸下降,對(duì)照組與PTX各組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為90

8、.33±1.53％、87.67±1.15％、83.00±2.65％、73.33±3.79％、61.00±2.00％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.437,P<0.01)。PTX0.01mg/ml組與對(duì)照組比較,細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組間兩兩比較,細(xì)胞陽(yáng)性率均有顯著性差異(P<0.05)。5.COX-2蛋白在PTX作用EC9706細(xì)胞24h后,細(xì)胞陽(yáng)性率逐漸下降,對(duì)照組與PTX各組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.33±1.

9、53％、86.00±2.65％、78.33±3.06％、70.33±5.03％、56.33±6.66％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.966,P<0.01)。PTX0.01mg/ml組與對(duì)照組比較,細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異(P>0.05),其余各組間兩兩比較,細(xì)胞陽(yáng)性率均有顯著性差異(P<0.05)。6.Ki-67蛋白在PTX作用EC9706細(xì)胞24h后,細(xì)胞陽(yáng)性率逐漸下降,對(duì)照組與PTX各組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.33±10.69％、4

10、3.00±4.58％、32.33±5.86％、23.33±3.05％、14.67±9.02％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.496,P<0.01)。PTX各組與對(duì)照組比較,細(xì)胞陽(yáng)性率均有顯著性差異(P<0.05),PTX0.01mg/ml組與0.1mg/ml組、PTX0.1mg/ml組與0.5mg/ml組、PTX0.5mg/ml組與1.0mg/ml組比較,細(xì)胞的陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。7.5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用12~

11、72h后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,經(jīng)5-Fu處理組細(xì)胞,24h出現(xiàn)部分細(xì)胞皺縮,漂浮,胞質(zhì)渾濁,并隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增高,數(shù)量漸少,出現(xiàn)細(xì)胞碎片。而PTX和5-Fu聯(lián)合處理組細(xì)胞,12h即出現(xiàn)與單用5-Fu處理組24h細(xì)胞相似變化,并隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增高,細(xì)胞數(shù)量更少,出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片。8.MTT法測(cè)量5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用EC9706細(xì)胞的抑制率結(jié)果顯示,不同濃度的5-Fu、PTX聯(lián)合5-Fu作用于EC

12、970612h、24h、48h、72h,同一時(shí)間各組抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。12h聯(lián)合組Ⅰ-Ⅳ與5-Fu25μg/ml組,聯(lián)合組Ⅵ-Ⅷ與5-Fu50μg/ml組,差異具有顯著性(P<0.05)。24h聯(lián)合組Ⅰ-Ⅳ與5-Fu25μg/ml組,聯(lián)合組Ⅴ-Ⅷ與5-Fu50μg/ml組,差異具有顯著性(P<0.05)。48h聯(lián)合組Ⅱ-Ⅳ與5-Fu25μg/ml組,聯(lián)合組Ⅷ與5-Fu50μg/ml組,差異具有顯著性(P<0.05)

13、。72h聯(lián)合組Ⅲ-Ⅳ與5-Fu25μg/ml組,聯(lián)合組Ⅴ-Ⅷ與5-Fu50μg/ml組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。聯(lián)合組Ⅲ、Ⅳ與5-Fu50μg/ml組在24h、48h、72h,不具有顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：1.PTX對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,并隨藥物濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng),其抑制作用逐漸增強(qiáng)。2.PTX使EC9706細(xì)胞的NF-κB P65、COX-2、Ki-67蛋白表達(dá)下降,提示PTX可抑