阿霉素對人乳腺癌細胞MCF-7表達KIF4A的抑制作用.pdf

1、目的：
　　 KIF4是KIFs家族中一員，是一類以氨基末端為驅動結構域的驅動蛋白。阿霉素是治療乳腺癌常用的有效化療藥物之一。低劑量的阿霉素常常誘導腫瘤細胞衰老，這有助于降低藥物的多藥耐藥（MDR）現象。探討KIF4A在阿霉素處理的人乳腺癌細胞MCF-7表達的變化，有助于進一步闡明KIF4A的功能及其與阿霉素誘導的腫瘤衰老的關系。
　　 方法：
　　 接種MCF-7細胞于培養(yǎng)皿，次日用1μmol·L-1的阿霉素處

2、理細胞2小時，對照不處理，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)細胞。分別于阿霉素處理后第12、24、48、72、96小時，用RIPA裂解緩沖液裂解細胞收集蛋白，用Bradford方法測定蛋白濃度，取等量（25μg）蛋白進行Westernblot檢測。用抗KIF4A抗體檢測KIF4A，用β-微管蛋白作為上樣對照（loadingcotrol）。將Western blowing的結果用Image-Pro Plus6.0軟

3、件進行光密度分析，之后將各蛋白條帶的光密度值用于下列公式計算KIF4A蛋白表達抑制率：KIF4A蛋白表達抑制率（％）=100％x[（未處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）-（處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）]/（未處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）。
　　 接種MCF-7細胞于培養(yǎng)皿，次日分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1的阿霉素處理細胞2小時，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)

4、培養(yǎng)細胞。于阿霉素處理后第96小時取出培養(yǎng)皿，收集蛋白，行蛋白濃度測定，取等量蛋白行Western blot檢測。用Image-Pro Plus6.0軟件進行光密度分析，并且計算KIF4A蛋白表達抑制率。
　　 用PCR擴增KIF4A基因完整開放讀碼框架（ORF），并將其與pEGFP-C1連接，形成KIF4A的真核表達質粒pEGFP-KIF4A。在35mm培養(yǎng)皿內，將pEGFP-KIF4A和作為對照的pEGFP-C1質粒用Lip

5、ofectaminTM轉染入MCF-7細胞中。20-24小時后，用阿霉素處理，而后置于熒光顯微鏡下觀察KIF4A的表達及分布。
　　 接種適量的MCF-7細胞于培養(yǎng)皿，次日用1μmol·L-1的阿霉素處理細胞2小時，對照不處理，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)細胞。于阿霉素處理后第96小時，取出培養(yǎng)皿，行衰老相關半乳糖苷酶染色，次日于倒置顯微鏡下觀察衰老細胞，計算衰老染色率（染色陽性細胞數/計數的總細胞

6、數）。
　　 結果：
　　 阿霉素處理后不同時間段收集蛋白行Western blot檢測結果分析發(fā)現，在處理后第12、24和48h，阿霉素雖可抑制KIF4A蛋白表達，但其抑制作用并不十分明顯，KIF4A蛋白與β-微管蛋白光密度比值分析顯示，其表達的抑制率僅介于20％～35％之間；而在72和96h，阿霉素處理的MCF-7細胞表達KIF4A顯著降低，其表達的抑制率均高達65％以上，其中，尤以96h最明顯。
　　 用不

7、同濃度的阿霉素處理MCF-7細胞，96h后收集蛋白行 Western blot檢測結果分析發(fā)現，雖然0.1μmol·L-1以下濃度的阿霉素對KIF4A蛋白表達無明顯影響，但0.5μmol·L-1及以上濃度的阿霉素均可顯著降低KIF4A蛋白水平，KIF4A蛋白與β-微管蛋白光密度比值分析顯示其表達的抑制率均高達50％以上，并且呈濃度依賴性。
　　 pEGFP-KIF4A質粒構建成功，將其轉染入MCF-7細胞高表達KIF4A，鏡下觀

8、察帶有綠色熒光的KIF4A蛋白主要分布在細胞核，呈圓形或橢圓形，核仁未見分布。用阿霉素處理之后，其分布未見改變。
　　 與未用阿霉素處理的MCF-7細胞相比，用1μmol·L-1的阿霉素處理2小時的MCF-7細胞的衰老相關半乳糖苷酶染色率由5％提高到42％，細胞核周邊出現藍染區(qū)域，細胞呈衰老樣變：體積變大，扁平，胞漿顆粒增多，富含液泡。
　　 結論：
　　 阿霉素處理MCF-7細胞可使KIF4A蛋白表達水平降低，