IRES特異性抑制性RNA阻斷丙型肝炎病毒基因表達(dá)的研究.pdf

1、該研究應(yīng)用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了將具自剪切作用的順式核酶序列引入IRNA序列兩端可保持IRNA一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)完整性的原核及真核表達(dá)體,并以此為基礎(chǔ)對(duì)IRNA在體外無(wú)細(xì)胞翻譯體系中對(duì)HCV IRES介導(dǎo)非帽結(jié)構(gòu)依賴性蛋白翻譯的抑制作用進(jìn)行了研究.此外,應(yīng)用脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法及新霉素抗性篩選建立了表達(dá)IRNA及mIRNA的HHCC細(xì)胞,并應(yīng)用相同方法建立了含HCV IRES的HCV復(fù)制子.在此基礎(chǔ)上探討了IRNA在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)及長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)H

2、CV IRES介導(dǎo)蛋白表達(dá)的抑制作用.最后,我們應(yīng)用PV疫苗株感染IRNA表達(dá)細(xì)胞,并對(duì)其病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)及病毒滴度進(jìn)行了滴定.此外,我們還初步探討了IRNA抑制HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯作用機(jī)理.結(jié)果如下:1.構(gòu)建了IRNA及mIRNA原核表達(dá)載體pGRz-IRNA/pGRz-mIRNA及真核表達(dá)載體pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA,于目標(biāo)序列兩端引入具自剪切作用的順式核酶序列.2.將pGRz-IRNA及pGRz-mRNA

3、體外轉(zhuǎn)錄體與含HCV IRES完整結(jié)構(gòu)的雙順?lè)醋觧T7DC1-341和單順?lè)醋觩CMVNCRluc體外轉(zhuǎn)錄體在兔網(wǎng)狀紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行體外蛋白翻譯,證實(shí)IRNA/cIRNA在體外對(duì)HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯具抑制作用.3.pcRzIRNA與含HCV IRES的pCMVNCRluc共轉(zhuǎn)染HHCC細(xì)胞后,表現(xiàn)出明顯的抑制熒光素酶表達(dá)作用;pcRzIRNA轉(zhuǎn)染含HCV IRES的HCV復(fù)制子也表現(xiàn)出一定的細(xì)胞內(nèi)抑制HCV IRES介