特異性靶向IRES的抗丙型肝炎病毒核酸藥物及影響IRES功能的因素研究.pdf

1、該研究的目的是以IRES作為HCV基因治療的作用靶位,應用RNA干擾技術和脫氧核酶技術進行抗丙型肝炎核酸藥物研究.司時探討了影響IRES功能的各種因素,如IFN、酒精、PTB、La蛋白以及HCV的幾種非結構蛋白等.缺乏合適的HCV感染細胞及小動物模型,是目前抗HCV藥物研究和開發(fā)的主要障礙之一.因此構建一種HCV IRES介導熒光素酶基因表達的細胞及小動物模型,可為以HCV IRES為靶標的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV

2、藥物的評價及篩選創(chuàng)造條件.該實驗所用HepG2.9706細胞株是HCV IRES介導熒光素酶表達的轉基因細胞模型.HCV IRES與熒光素酶基因融合,熒光素酶基因的起始密碼及調控序列均已切除,熒光素酶的翻譯由HCV IRES介導啟動.因此HepG2.9706細胞中熒光素酶活性表達的高低,可反映HCV IRES基因的功能,易于定量、簡單易測.在此基礎上進一步應用水動力轉染法將表達質粒導入小鼠體內,在小鼠肝臟可檢測到高水平螢火蟲熒光素酶的表

3、達.從而初步建立了可以瞬時評價靶向HCV IRES藥物作用的細胞及小動物模型,為抗HCV反義藥物研究奠定了基礎.在實驗中,我們選擇了T7RNA聚合酶體外轉錄形成siRNA和質粒表達shRNA兩種方法.該研究選用了含10-23基序的Dz10~23結構.它的底物結合臂與底物間的作用是完全通過標準的Watson-Crick配對.改變底物識別結構域的序列,Dz便能識別不司的RNA底物.針對HCV IRES設計合成了5條Dz,評價其對目的基因的抑

4、制作用效果.目前,干擾素是國際上唯一公認的治療丙型肝炎的藥物.但IFN抗HCV作用機制并不完全清楚.該研究探討了IFN對帽子依賴的翻譯機制和HCV IRES介導的內部起始翻譯機制的抑制效果.該研究建立了由HCV IRES介導熒光素酶基因表達的細胞及小動物模型,并應用這兩種模型評價了特異性靶向HCV IRES的siRNA和脫氧核酶對靶標的抑制作用.同時對影響HCV IRES功能的一些主要因素進行了初步探討,為今后進行抗HCV的基因治療奠定