菜粉蝶顆粒體病毒基因組和ODV蛋白組研究.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是一類能夠感染并最終殺死鱗翅目、膜翅目等農(nóng)業(yè)害蟲和雙翅目蚊子的一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組大小為80-180kb，基因總量約為895個；該類病毒可用作生物農(nóng)藥、基因表達(dá)載體、基因治療載體等，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域.目前已經(jīng)有58種桿狀病毒完成了基因組測序與注釋，包括45種核型多角體病毒(NPV)，13種顆粒體病毒(GV)；然而，僅有5種桿狀病毒蛋白組成得到鑒定，而且全部為NPV病毒，鑒定

2、蛋白多為ODV(()virus)蛋白，僅1種為BV(budded virus)蛋白。鑒于此，本研究選擇菜粉蝶顆粒體病毒(PrGV，屬GV病毒)為研究對象，重點分析該病毒基因組、ODV蛋白組成等，本論文主要結(jié)論如下：
　　 1.PrGV基因組分析
　　 該病毒基因組為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，大小108，592bp，擁有120個ORFs，編碼區(qū)占整個基因組91％；在120個預(yù)測的ORFs中，65個ORFs與granulin基因具

3、有相同的轉(zhuǎn)錄方向，另55個ORFs的轉(zhuǎn)錄方向與其相反；PrGV基因組中最長ORF含有3402bp(ORF75，helicase-1)，推測編碼1133個氨基酸殘基的蛋白；含有2個重復(fù)基因(ODV-E66a/b)；PrGV基因組存在基因間隔區(qū)和基因重疊現(xiàn)象，8個同源區(qū)分散在基因組不同位置。PrGV基因組存在桿狀病毒科31種核心(保守)基因和鱗翅目桿狀病毒31種輔助基因。
　　 PrGV基因組共線性分析揭示了該病毒與β-桿狀病毒屬基

4、因組具有異常高的共線性，其中PrGV與云杉卷葉蛾顆粒體病毒(ChocGV)、楊扇舟蛾顆粒體病毒(ClanGV)、茶小卷葉蛾顆粒體病毒(AdorGV)等基因組共線性程度非常高，與八字地老虎顆粒體病毒(XecnGV)等基因組共線性程度相對較低；而與鱗翅目核型多角體病毒AcNPV共線性程度更低。
　　 蛋白質(zhì)同源比對分析揭示了PrGV ORFs可分為四類：1)8個GV-特異基因這些基因同系物僅僅存在于GV基因組中，它們是orf4，or

5、f12，orf28，orf34，orf55，orf95(LEF-3)，orf103，orf112，表明這些保守基因是GV病毒結(jié)構(gòu)與功能所必須；2)33個基因存在于GV基因組和其它病毒基因組，但在NPV基因組中并不存在，他們是orf2，orf5，orf18，orf19，orf20(PEP1)，orf24，orf25，orf27，orf31，orf35，orf36，orf37(Metalloproteinase)，orf41，orf42，o

6、rf48(39K)，orf54，orf62(FGF-1)，orf63，orf67，orf83，orf84，orf86，orf89，orf94，orf97，orf102，orf104，orf105，orf106，orf109，orf111，orf114，orf115；3)4個基因僅存在于桿狀病毒PrGV基因組中或其它物種中，它們是orf09，orf32，orf53，orf117；4)75個基因為GVs和NPVs共享基因。
　　 基

7、因組進(jìn)化分析顯示：PrGV基因組無論在LCB(Locally Collinear Blocks，局部共線區(qū))數(shù)目、方向、排列順序、長度等方面與ChocGV基因組高度相似，暗示了PrGV與ChocGV在基因組進(jìn)化上可能經(jīng)歷著相似途徑；PrGV與PsunGV，XeuGV，HearGV對應(yīng)的LCBs相比，在LCB序列長度方面存在較大差異，推測3種病毒(PsunGV，XeniGV，HearGV)在長期的選擇壓力下，通過在LCB區(qū)域“擴(kuò)充”基因以

8、“增添”新功能來更好地拓展生存空間；PrGV與AcNPV基因組對應(yīng)LCBs相比差異顯著，揭示了兩種病毒在基因組進(jìn)化方面分歧較早；PrGV與CunniNPV基因組相比，兩者的LCBs一致性最低，暗示了兩者分歧時間更早，但都保留了“祖先”基因組某些基因。
　　 PrGV種系發(fā)生研究表明：PrGV與ChocGV在種系進(jìn)化樹上距離最近；13種β-桿狀病毒聚類在一起，形成1個分支；在分支內(nèi)6種病毒(HearGV，XeniGV，PsunGV

9、，SpliGV，AgseGV，PlxyGV)形成亞分支，7種病毒(AdorGV，PhopGV，CrleGV，CypoGV，ClanGV，ChocGV和PrGV)形成另1個亞分支。
　　 2.PrGV-ODV蛋白組分析
　　 利用3種質(zhì)譜技術(shù)對PrGV-ODV蛋白分析共鑒定47種蛋白，其中MALDI-TOF/TOF MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of

10、-flight/time-of-flight mass spectrometry：基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜)方法鑒定16種蛋白，LC-LTQ Velos(liquid chromatography-linear ion trap quadrupoleVelos MS：液相色譜-雙壓線性離子阱質(zhì)譜)技術(shù)鑒定37種蛋白；而LTQ-Orbitrap(linear ion trap quadrupole-Oritrap MS：二維線性離

11、子阱-軌道阱聯(lián)用質(zhì)譜)方法鑒定31種蛋白；47種蛋白中有11種被所有3種質(zhì)譜技術(shù)所鑒定出；15種蛋白至少被2種質(zhì)譜方法鑒定出；21種蛋白僅被1種質(zhì)譜方法鑒定。
　　 在鑒定的47種ODV蛋白中，14種蛋白(P10，Pr21，Pr29，Pr35，Pr42，Pr54，P45/48，Pr83，Pr84，Pr89，Pr92，Pr111，Pr114和FGF3)為新鑒定的ODV蛋白，其中7種蛋白為β-桿狀病毒特有蛋白(Pr35，Pr42，P

12、r54，Pr83，Pr84，Pr111和Pr114)。
　　 通過對鑒定的47種蛋白隨機(jī)選擇11種ORFs進(jìn)行基因克隆、表達(dá)與多抗制備等試驗，并對PrGV病毒蛋白進(jìn)行免疫雜交分析，結(jié)果顯示所有抗體均顯示陽性信號，這進(jìn)一步證實了11種蛋白在PrGV病毒中的存在，同時驗證了質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白的可行性、可靠性。
　　 3.Pr42/Pr114基因分析
　　 基因組和蛋白組分析表明，Pr42和Pr114基因為β-桿狀病毒特

13、有基因(GV)，兩基因表達(dá)產(chǎn)物均為PrGV高豐度蛋白。生物信息學(xué)分析顯示：Pr42基因編碼803個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為93.5 kDa；該蛋白存在較為豐富的磷酸化位點(52個)和3個O-Glycosylated糖基化位點；Pr42為親水性蛋白，不存在信號肽序列；進(jìn)化樹分析表明：Pr42與ClanGV gp022蛋白同源性最高；Pr114基因編碼323個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為36.9 kDa，該蛋白存在較為豐富的磷酸化位點(21個)

14、、不存在O-Glycosylated糖基化位點；Pr114為親水性蛋白，不存在信號肽序列；進(jìn)化樹分析表明該蛋白與ChocGV-ORF110蛋白同源性最高。
　　 RT-PCR分析表明，兩種蛋白基因Pr42/Pr114的轉(zhuǎn)錄在經(jīng)口感染48hpi就可以檢測到，隨后一直持續(xù)到96hpi；定量PCR分析表明：Pr42和Pr114基因在病毒感染6-96h均有轉(zhuǎn)錄，而在感染60h時相對轉(zhuǎn)錄水平均到達(dá)最高。
　　 綜合生物信息學(xué)分析以