我國新分離乙型腦炎病毒基因組cDNA克隆的研究.pdf

1、乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)，簡稱乙腦病毒，隸屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬(Flavivirus)。按照病毒全基因組或部分基因組序列可以將乙腦病毒分為5個(gè)基因型（基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。
　　JEV GZ56毒株是我國于2006年首次從病毒性腦炎患者標(biāo)本中分離得到屬基因Ⅰ型的乙腦病毒。JEV XZ0934毒株是我國于2009年從西藏采集到的蚊子

2、中獲得的屬基因Ⅴ型乙腦毒株，該毒株是繼馬來西亞于1952年從人患中分離獲得的屬基因Ⅴ型乙腦毒株Muar后由我國第一次分離獲得的屬基因Ⅴ型乙腦病毒。本研究分別從兩只分別因感染JEV GZ56及XZ0934而致死的乳鼠腦部中分別獲得JEV GZ56及XZ0934毒株，并分別對(duì)其進(jìn)行空斑純化以期獲得純化的JEV GZ56及XZ0934毒株，進(jìn)而將這兩株純化的病毒設(shè)計(jì)為16個(gè)片段擴(kuò)增獲得它們的全基因組序列，從而通過現(xiàn)代分子生物學(xué)理論與技術(shù)測定和

3、分析了這兩株病毒的全基因組序列特征，以了解它們的致病性分子基礎(chǔ)。本研究進(jìn)而將JEV XZ0934毒株的基因組全長通過RT-PCR法分段擴(kuò)增為兩兩疊搭的4個(gè)大片段，并分段克隆至具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的改造載體pACYC-MCS上，以期利用反向遺傳學(xué)技術(shù)闡明該病毒的致病分子機(jī)理、研制重組病毒疫苗及開發(fā)基因工程載體。研究結(jié)果顯示:
　　JEV GZ56毒株的基因組全長為10965nt，編碼3432個(gè)氨基酸。病毒全基因組分子進(jìn)化分析顯示J

4、EV GZ56毒株的全基因組與國際上第一株從蚊蟲分離的基因Ⅰ型乙腦病毒（M-28株）處于同一進(jìn)化分支。GZ56株與其它基因Ⅰ型乙腦病毒核苷酸和氨基酸序列同源性分別為96.2％～98.6％和98.2％～99.7％。病毒E基因與乙腦病毒滅活疫苗株P(guān)3相比存在11個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，而與乙腦病毒減毒活疫苗株SA14-14-2相比，在E蛋白上存在14個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。
　　JEV XZ0934毒株的基因組全長為10983nt，編碼3432個(gè)

5、氨基酸。病毒全基因組分子進(jìn)化分析顯示JEV XZ0934毒株的全基因組與國際上第一株從死患中分離的基因Ⅴ型乙腦病毒（Muar株）處于同一進(jìn)化分支。XZ0934株與GenBank中選擇的23株乙腦毒株全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，其核苷酸和氨基酸總體同源性分別為78.8％～90.7％和90.0％～98.3％;其中，XZ0934株與Muar株的核苷酸和氨基酸同源性分別為90.7％和98.3％;與GZ56株的核苷酸和氨基酸同源性分別為79.4％和91

6、.2％。病毒E基因與乙腦病毒滅活疫苗株P(guān)3相比存在47個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，而與乙腦病毒減毒活疫苗株SA14-14-2相比，在E蛋白上存在52個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)。
　　改造載體pACYC-MCS構(gòu)建成功，其全長為2467bp，具氨芐抗性且在多克隆位點(diǎn)(MCS)處具23個(gè)限制性內(nèi)切酶;經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增所得的JEV XZ0934毒株的4個(gè)大片段的長度分別為:2418bp、3002bp、2607bp、2983bp;且測序結(jié)果表明，該病毒的基