兩種豬腹瀉冠狀病毒基因組克隆及載體構(gòu)建.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）均為冠狀病毒科（Coronviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）成員，是引起豬腹瀉的重要病原。近年來，國內(nèi)外對(duì)PEDV和TGEV全序列的測定、基因工程疫苗的研究及反向遺傳學(xué)的研究做了大量工作。本研究以采集的甘肅P

2、EDV DX和TGEV TS毒株為材料，進(jìn)行了兩毒株全基因組的測序、部分基因的表達(dá)、真核表達(dá)載體的構(gòu)建和缺陷性病毒載體的構(gòu)建。其主要結(jié)果如下： 1．克隆了豬流行性腹瀉病毒DX株結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因。分析結(jié)果顯示DX株S基因、M基因、sM基因和N基因分別為4152、681、231和1326個(gè)堿基，聚合酶基因和ORF3基因分別為20354和675個(gè)堿基。結(jié)構(gòu)蛋白S基因核苷酸數(shù)與英國毒株CV777、中國株JS-2004-2以及

3、韓國株Chujin99相等，均為4152個(gè)堿基，比韓國毒株AF500215、AF237764S基因少9個(gè)堿基。同源性分析顯示其與中國毒株JS-2004-2關(guān)系最為密切。 2．構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒DX毒株N蛋白基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)出了預(yù)期的N蛋白，試驗(yàn)表明其有良好的反應(yīng)原性。 3．分別構(gòu)建了PEDV和TGEVS和N雙基因腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示綠色熒光蛋白得以表達(dá)，證明目的外源基因可在細(xì)胞中表達(dá)。

4、 4．克隆了豬傳染性胃腸炎病毒TS株全基因組。結(jié)果表明TGEVTS株全長基因組為28541bp。其中結(jié)構(gòu)蛋白基因S、sM、M和N分別為4350、246、786和1146堿基，非結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF1、ORF3和ORF7分別為20054、1015和237堿基，5’和3’非編碼區(qū)分別為319和280堿基。TGEVTSORF1a和ORF1b蛋白分別由4017和2680個(gè)氨基酸組成。進(jìn)化樹分析表明所有TGEV毒株可分為Purdue和Miller

5、亞群，TGEVTS株與Miller亞群進(jìn)化關(guān)系最為相近。 5．TGEVTS株在ST、IB-RS-2（lB）和PK-15細(xì)胞上傳代表明：在該3種細(xì)胞連傳10代均可出現(xiàn)病變，ST細(xì)胞接毒后培養(yǎng)36小時(shí)病變特征明顯，IB-RS-2和PK-15細(xì)胞接毒后48小時(shí)病變明顯。TGEVTS株在ST細(xì)胞接毒后連傳10代培養(yǎng)可以用PCR方法檢測到3’端基因組，而其在IB和PK-15上接毒后連傳10代用PCR方法檢測不到3’端基因組。TGEVTS株