雞痘病毒基因組中反轉(zhuǎn)錄病毒序列整合的研究及重組雞痘病毒的構(gòu)建.pdf

1、為研究我國雞痘病毒疫苗毒和野毒分離株中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒序列(reticuloendotheliosis virus，REV) 的整合情況，本文分離和收集了一些整合有REV的痘病毒疫苗毒株及野毒株，對這種自然重組現(xiàn)象在病毒變異和演化上的普遍意義和流行病學(xué)意義做了一些探索，并以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組雞痘病毒GFP-FPV病毒，為制備純化的痘病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。 1 國內(nèi)外雞痘疫苗毒基因組

2、中REV序列整合的研究本試驗(yàn)收集國內(nèi)外10家廠家生產(chǎn)的10株雞痘弱毒疫苗和282E4株，先后在SPF雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上傳代增殖，用REV單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immuo-fluoresence assay，IFA)，并提取病毒DNA，根據(jù)已發(fā)表的FPV整合REV前病毒基因組序列的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了1對分別位于FPV基因組中201和2030RF’的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)不同的FPV疫苗株可得到400 b

3、p、700 bp、1400bp、1700bp、2000bp、2500bp、5000bp、8000bp等大小不等的一個(gè)或數(shù)個(gè)片段。將1400bp、1700bp的擴(kuò)增片段克隆、測序和序列分析，發(fā)現(xiàn)這些擴(kuò)增片斷均為FPV與REV的重組產(chǎn)物，整合的REV序列隨擴(kuò)增片斷不同而異，不同疫苗株整合的REV前病毒基因序列大小也不同，這些整合的REV序列大小為LTR的191bp或504bp等，與國外已經(jīng)測定的痘病毒毒株的同源性不僅高達(dá)98-99％，而且整

4、合的位點(diǎn)也完全一致；與國外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分別為：99.6％、98.0％和87.3％，與我國REV分離株HA9901的同源性為83.6％。進(jìn)一步分析表明REV與FPV之間的整合模式至少有4種。 2 雞痘野毒基因組中整合REV全序列的測定和分析根據(jù)已發(fā)表的REV和FPV序列設(shè)計(jì)9對引物，從分離的8株雞痘病毒野毒株中挑選安丘株和平度株這2株熒光抗體試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性的痘病毒，擴(kuò)增其整合的REV’前病毒全序列，并與己發(fā)

5、表的REV毒株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)安丘株全長7941bp，在痘病毒基因組上的起始位點(diǎn)為LTR的第30位堿基，3’端LTR在痘病毒基因組上的終止位點(diǎn)為LTR的第213位堿基，相對于全長8221bp的REV前病毒(AF246698.2)，3’端的LTR長度明顯縮短。平度株比安丘株少3個(gè)堿基，并有8個(gè)堿基的差異。安丘株與國外的毒株DQ387450.1(APC-566)、AF246698.2、AY842951.1(HA9901)、DQ003591.1

6、(SNV)及REV序列高度同源，為97—99％。進(jìn)化樹比較表明安丘株和平度株很可能是目前流行的痘病毒野毒株。 3 人工構(gòu)建不含REV的重組雞痘疫苗株利用整合有REV IXR的痘病毒282E4株作為原始病毒，選取其REV穩(wěn)定整合的痘病毒201和203閱讀框做同源重組區(qū)域，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhancedgreen fluorescent protein) 做為報(bào)告基因，與痘病毒啟動子p7.5一起構(gòu)建了osk-p7.5-EGF