日本腦炎病毒WHe株基因組特征及其疫苗的研究.pdf

1、日本腦炎(Japanese Encephalitis，JE)，又稱流行性乙型腦炎，是由日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一種中樞神經系統(tǒng)人畜共患急性傳染病。其致死率高達30％左右，50％的患者會留下永久性的后遺癥，其中，中國的JE發(fā)病數占世界總發(fā)病數的80％以上。庫蚊伊蚊是該病的主要傳播媒介，而豬則是重要的傳染源和放大器。豬患JE的主要表現為懷孕母豬流產、產死胎、弱仔、公豬睪丸炎及少數仔

2、豬呈神經癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。目前，用于JE免疫預防的疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種，其安全性和較高的生產應用成本已成為人們日益關注的問題。近年來，病毒分子生物學和反向遺傳學的發(fā)展為開發(fā)新型JE疫苗提供了新的技術手段。 本研究為進一步探索JEV/WHe株基因組功能、致病機理及構建高效新型疫苗，開展了以下工作： 1．JEV/WHe株全基因組特征分析本研究設計了11對特異性引物，采用RT-PCR技術擴增得到覆蓋J

3、EV/WHe株基因組全長cDNA的11個特異性片段，測序分析表明，JEV/WHe株基因組由一個開放閱讀框(ORF，10296個核苷酸)和5′端非編碼區(qū)(5′UTR，95個核苷酸)和3′端非編碼區(qū)(3′UTR，585個核苷酸)組成。 核苷酸序列和氨基酸序列分析表明，WHe株與P3株親緣關系最近，但3′UTR形成的二級結構與Vellore P20778株3′UTR形成的二級結構最相似：與黃病毒科其他屬成員比較，3′UTR最末端約84

4、個核苷酸所形成的二級結構相當保守。 Whe株與P3株的膜蛋白(E)擁有M(76)、G(306)和L(408)三個特有氨基酸，而在其它19株JEV為T(76)、E(306)、S(408)，推測可能與病毒的宿主及組織嗜性有關。Whe株E蛋白中存在控制黃病毒毒力的RGD(387-389)基序，而一部分弱毒株也有該基序，提示JVE毒力型的決定簇具有毒株特異性。由全基因組序列構建的系統(tǒng)發(fā)育圖與由E基因構建的系統(tǒng)發(fā)育圖僅有一些細微的差別，表

5、明E基因在研究各分離株之間進化關系中具有重要意義；從GenBank中調出不同時間和地區(qū)分離的140株JEV E基因，構建了系統(tǒng)發(fā)育圖譜。 2．JEV/Whe株全長cDNA的長鏈RT-PCR法擴增采用長鏈RT-PCR技術擴增基因組全長cDNA。對其進行PCR擴增鑒定，并對含復雜二級結構的3′末端和5′末端非編碼區(qū)擴增片段進行了測序分析。擴增結果表明，擴增出的JEV Whe株基因組全長cDNA分子近11kb大小；非編碼區(qū)測序分析表明

6、，擴增產物為Wae株所特有。證明長鏈RT-PCR法可用于JEVWHe株基因組全長cDNA的擴增。 3．JEV/Whe株ONA疫苗載體構建采用RT-PCR技術擴增prM/E和NS1全基因并進行序列分析，將其分別克隆于真核表達載體pAVX1，構建的表達載體pAVX1prM/E和pAVX1-NS1，酶切鑒定和序列分析表明，JEV/Whe株DNA疫苗載體構建成功。 4．Whe株NS1基因在大腸桿菌中的表達將NS1基因克隆到pET