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文檔簡介
1、豬乙型腦炎病原為日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV),屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬,該屬包括黃熱病(Yellowfevervirus)、日本乙腦病毒(JEV)、西尼羅河病毒(Westnilevirus)和登革熱病毒(Deguevirus)等多種嚴重危害人畜健康的病毒。目前預(yù)防豬乙型腦炎主要靠接種疫苗和防蚊滅蚊。
本研究初步探索了乙型腦炎顆粒疫苗以及新型乙腦病毒滅活劑的效
2、果,HBC是乙型肝炎核心抗原,其在多種表達體系中均被表達并能自組裝成病毒樣顆粒,是一種良好的表位展示免疫載體。另外據(jù)報道作為病毒滅活劑的雙氧水能快速有效滅活病毒,并且對病毒表面結(jié)構(gòu)的破壞相對傳統(tǒng)滅活劑-甲醛要小很多,本實驗對以雙氧水為滅活劑的豬乙型腦炎滅活苗進行初步研究。
1、展示JEVED(Ⅲ)loop3表位的病毒樣顆粒的制備及其免疫效果研究
JEVE蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDⅢ)是誘導(dǎo)中和抗體的重要區(qū)域。據(jù)報道,體外實驗
3、表明ED(Ⅲ)的一個環(huán)肽(loop3)能通過干擾病毒吸附細胞抑制病毒感染,接種該蛋白之后對小鼠的攻毒實驗表明loop3是保護性最強的一段多肽。但loop3表位肽只是一段僅有9個氨基酸殘基的序列,該表位肽的免疫原性極低。乙肝核心蛋白(HepatitisBcoreprotein,HBC)是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白,它在細菌、真核細胞以及哺乳動物細胞內(nèi)均能被高效表達并自動裝配成病毒樣顆粒,而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不會影響HBC的構(gòu)
4、象及自我組裝,同時插入的外源短肽能以多次重復(fù)的方式被展現(xiàn)在病毒樣顆粒表面,從而能大大提高表位肽的免疫原性。因此將loop3基因與HBC基因重組,以該顆粒物質(zhì)為免疫載體,提高loop3表位的免疫原性。
根據(jù)以上所述,本文首先構(gòu)建了以HBC為載體的重組融合表達質(zhì)粒pET28a-HBC-loop3,在HBC的MIR區(qū)插入JEVEDIIIloop3表位基因。SDS-PAGE證明,IPTG誘導(dǎo)后大腸桿菌高效上清表達了目的蛋白,表達量較高
5、,命名為HBC-loop3,純化過后,在透射電鏡下觀察,視野中具有大量病毒樣顆粒,證實了該該融合蛋白能自行組裝成病毒樣顆粒。
將純化的HBC-loop3輔以弗氏佐劑免疫5只5周齡清潔級小白鼠,接種部位為腹膜腔,接種蛋白量為50μg。然后利用本實驗室建立的間接ELISA法以及血凝抑制法和空斑中和試驗來評價免疫效果,結(jié)果為:蛋白免疫組抗體ELISA值(0.59)顯著大于PBS組值(0.18),蛋白免疫組血清的血凝抑制效果也高于PB
6、S組,而空斑抑制試驗顯示血清中未檢測到中和抗體。
2、以雙氧水為滅活劑的豬乙型腦炎病毒滅活苗試制與初步效果試驗
本研究中使用的是免疫原性良好的豬源乙腦病毒-NANJING08株。本實驗用過氧化氫和甲醛分別滅活JEV病毒,然后輔以弗氏佐劑免疫5只5周齡清潔級小白鼠,接種部位為腹膜腔,接種病毒劑量為1×106PFU,運用間接ELISA法、血凝抑制法和空斑中和試驗對免疫效果進行評價。ELISA結(jié)果顯示雙氧水滅活組ELISA
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