輪狀病毒滅活疫苗的制備和免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、人輪狀病毒(human rotavirus,HRV)是世界范圍內(nèi)引起5歲以內(nèi)嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉最主要的病原體,HRV感染是造成嬰幼兒腹瀉死亡的主要原因。HRV感染的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家間無明顯差異,水質(zhì)和衛(wèi)生條件的改善并不能明顯降低輪狀病毒感染的發(fā)病率,因此輪狀病毒感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題,給世界各國帶來沉重的疾病負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前尚無治療HRV感染的特效藥物,研制疫苗是預(yù)防和控制HRV感染的唯一有效途徑。世界衛(wèi)生組織(

2、world healthorganization,WHO)正積極推動(dòng)不同形式輪狀病毒疫苗的研究與開發(fā)。
　　 滅活全病毒疫苗是HRV疫苗開發(fā)潛在的一種策略。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,滅活的輪狀病毒可以產(chǎn)生好的免疫效果,這為HRV滅活疫苗的開發(fā)提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。當(dāng)前國內(nèi)外均未見有HRV滅活疫苗進(jìn)入臨床研究或上市銷售。本研究開展了HRV滅活疫苗的研發(fā)工作,包括HRV滅活疫苗的制備；HRV滅活疫苗在小鼠的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)；同時(shí)還開展了HRV滅

3、活疫苗參與的聯(lián)合疫苗的免疫效果的初步評(píng)價(jià)的研究。
　　 首先,滅活P[8]G1和P[2]G3輪狀病毒的制備。規(guī)模化培養(yǎng)的P[8]G1或P[2]G3輪狀病毒收獲液,經(jīng)離心、微濾、超濾和層析等步驟純化,病毒液中95％以上的蛋白質(zhì)被去除,SDS—PAGE和western blot分析證明,純化病毒液含有輪狀病毒特異的蛋白,未見其它蛋白條帶。0.5ml純化病毒液中Vero細(xì)胞DNA的殘余量為100pg～500pg之間。純化的病毒,結(jié)構(gòu)完

4、整,呈典型的輪狀病毒特征,具有感染性,基因組未發(fā)生突變。純化病毒液中加入終濃度0.00925％甲醛,先在56℃加熱30min,然后在37℃持續(xù)孵育至72h,病毒被完全滅活。滅活的病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整,具有免疫原性。
　　 隨后,將滅活的P[8]G1輪狀病毒與氫氧化鋁佐劑吸附,經(jīng)后肢肌肉注射途徑免疫小鼠,評(píng)價(jià)HRV滅活疫苗在小鼠的免疫效果和保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HRV滅活疫苗可以誘發(fā)血清IgG和IgA,腸道IgG和IgA及中和抗體等

5、全身和局部體液免疫反應(yīng),同時(shí)也引起效應(yīng)Th1和Th2CD4+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。其中中和抗體在體外的中和實(shí)驗(yàn)中,可以中和同型感染性Wa株(G1型)輪狀病毒和異型感染性SA11株(G3型)輪狀病毒,顯示一定的交叉保護(hù)作用。在小鼠主動(dòng)和被動(dòng)攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明,HRV滅活疫苗可有效保護(hù)小鼠免受感染性SA11輪狀病毒的攻擊。
　　 最后,在小鼠模型進(jìn)行了HRV滅活疫苗參與的聯(lián)合疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同血清型的二價(jià)輪狀病毒滅活疫苗

6、,在抗原量相同時(shí),與單價(jià)疫苗的免疫效果無顯著差別。在與甲型肝炎滅活疫苗(inactivated hepatitis A vaccine,iHAV)聯(lián)合免疫時(shí)發(fā)現(xiàn),聯(lián)合疫苗中iHAV的免疫效果不及單價(jià)iHAV理想；而HRV滅活疫苗免疫效果沒有受到影響。在與脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(inactivated poliovirusvaccine,IPV)聯(lián)合免疫中發(fā)現(xiàn),聯(lián)合疫苗中的HRV滅活疫苗誘發(fā)IgG水平高于單價(jià)疫苗IgG水平；Ⅰ型和Ⅲ型IPV誘