B亞群禽白血病病毒滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)試驗(yàn).pdf

1、禽白血病是引起禽類產(chǎn)生腫瘤的主要疫病之一，其病原是反轉(zhuǎn)錄病毒科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(Avain leukosis virus，ALV)。根據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原結(jié)構(gòu)、病毒宿主范圍及在細(xì)胞培養(yǎng)上不同毒株之間的相互干擾作用，將ALV分為A～J10個亞群，其中A、B、C、D、E和J6個亞群存在于雞群中。A、B和J亞群為雞群中引發(fā)腫瘤的主要外源性ALV，而在雞群中較少見由C、D亞群外源性ALV引發(fā)的腫瘤，E亞群病毒為內(nèi)源性白血病病毒，對

2、雞的致病性很低或無致病。在上個世紀(jì)80年代以前，A、B亞群ALV是引起雞群淋巴性白血病和各種類型腫瘤的兩類病毒，但在80年代中期，國際大型種雞公司已基本消除了雞群中A、B亞型ALV的感染。由于近幾十年來我國從未在全國范圍內(nèi)進(jìn)行對經(jīng)典ALV的凈化措施，我國雞群特別是地方品系中極可能存在外源性ALV的感染。朱美珍等在山東某地方品系分離到一株A亞群禽白血病病毒，趙冬敏等在我國地方品系蘆花雞中分離到B亞群禽白血病病毒，說明我國雞群中存在A、B亞

3、群禽白血病病毒的感染。
　　 為加快B亞群禽白血病的凈化，本實(shí)驗(yàn)成功制備了B亞群禽白血病病毒SDAU09C2株的滅活疫苗，嘗試從核心種雞群疫苗免疫的途徑來減少核心種雞群的帶毒率，提高其特異性抗體水平，從而保護(hù)其免受禽白血病病毒的感染，同時通過種蛋為下一代提供母源抗體，有效預(yù)防或減緩了雛雞的早期感染，加快禽白血病的凈化進(jìn)程。
　　 要制備高質(zhì)量的滅活疫苗，必須保證抗原的含量，因此我們首先探索B亞群禽白血病病毒SDAU09C

4、2株的細(xì)胞培養(yǎng)的最優(yōu)條件。將B亞群禽白血病病毒SDAU09C2株接種到對數(shù)生長期CEF細(xì)胞的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上中，孵育2h后，用含不同濃度初生牛血清(0.5％，1％，2％，3％)的DMEM培養(yǎng)液維持10天，每天每板每孔收集150ul細(xì)胞上清于1.5ml離心管中，用于p27抗原檢測，從而確定維持液最適血清濃度。然后再將SDAU09C2接種到對數(shù)生長期CEF細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上中，孵育2h后，用不同PH值(6.6～7.7)含0.5％的初

5、生牛血清的DMEM培養(yǎng)液維持10天，每天每板每孔收集150ul細(xì)胞上清于1.5ml離心管中，用于p27抗原檢測，從而確定維持液最適PH值。最后將SDAU09C2株接種到對數(shù)生長期CEF細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，接種2h后，用含PH為6.8，0.5％初生牛血清的DMEM培養(yǎng)液維持10天，每天每瓶各收集2個1.5ml離心管，每管150ul（一管用于p27抗原檢測，一管用于TCID50滴度的測定），從而確定p27和TCID50的關(guān)系。每次收集上清樣品后

6、補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基。通過病毒連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)檢測，發(fā)現(xiàn)病毒在PH為6.8，初生牛血清濃度為0.5％的維持液狀態(tài)下，維持5天，復(fù)制出的病毒量最大而且p27和TCID50間顯著正相關(guān)。
　　 將SDAU09C2接種于20瓶新長成的單層CEF上，在培養(yǎng)瓶中盲傳3代后，用PH=6.8小牛血清濃度為0.5％的維持液維持5天，收集帶毒細(xì)胞，將收集的帶毒細(xì)胞用PBS稀釋至5ml，用體積比為0.2％的甲醛，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)作用24小時，將滅活的細(xì)

7、胞與MONTANIDE ISA775 VG(佐劑)體積比為2.6∶7.4進(jìn)行充分乳化，制備出ALV-B滅活疫苗。
　　 9只成年祖代雞多點(diǎn)注射制備的滅活疫苗1ml(約含病毒106.8個TCID50)，未注射疫苗9只成年祖代雞作為對照。在免疫過的成年產(chǎn)蛋雞抗體水平最高時，分別從免疫組和未免疫組隨機(jī)抽取4只免疫過的成年雞和4只未免疫成年雞進(jìn)行攻毒，肌肉多點(diǎn)注射SDAU09C21ml(TCID50為104.6/0.1 ml)，每周采集

8、抗凝血、非抗凝血、棉拭子進(jìn)行跟蹤檢測。剩余5只成年雞經(jīng)過四次免疫，每周采集非抗凝血0.5ml，進(jìn)行抗體檢測跟蹤。結(jié)果表明，免疫該疫苗后，在第三次免疫后的第三周抗體水平最高，S/P在1.69～1.89之間，陽性約維持四周。攻毒后的祖代雞不論是免疫組還是對照組棉拭子p27全是陰性，也未出現(xiàn)病毒血癥，說明成年雞能夠抵抗禽白血病病毒的感染，但對照組的S/P值比免疫組要高一些。免疫組的祖代雞再次感染該病毒時，與對照組相比能夠增強(qiáng)其免疫反應(yīng)抗體水平

9、更高。
　　 在免疫過的祖代雞抗體水平最高時收集種蛋（包括無抗體對照組）進(jìn)行孵化，孵出雛雞33只，其中有抗體雞的種蛋孵出的雛雞17只，無抗體雞的種蛋孵出的雛雞16只。將雛雞分為四組，一組為有抗體雞的種蛋孵出的14只小雞，1日齡腹腔攻毒;二組為確定含母源抗體雛雞3只，腹腔注射PBS（目的是看母源抗體消長規(guī)律）;三組為無抗體雞的種蛋孵出的13只雛雞，1日齡腹腔攻毒;四組為無抗體雞的種蛋孵出的3只雛雞，腹腔注射PBS，作為對照。每周采

10、抗凝血、非抗凝血、棉拭子進(jìn)行跟蹤檢測。結(jié)果顯示:母源抗體的消長規(guī)律:3只含母源抗體雞通過連續(xù)抗體ELISA檢測可知，母源抗體能持續(xù)一周左右。含母源抗體組攻毒后，僅有1只雞在十四周出現(xiàn)抗體反應(yīng)，而不含母源抗體組攻毒后，因早期感染產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫耐受，從而一直未出現(xiàn)抗體陽性。含母源抗體組的12只雛雞攻毒后，只有4只在第9～10周泄殖腔棉拭子P27出現(xiàn)短暫陽性，最多持續(xù)2～3周左右，且S/P值均不高;不含母源抗體組的9只雛雞攻毒后，在第2～6周

11、后全部出現(xiàn)棉拭子排毒陽性，持續(xù)約8～9周左右，且S/P值均顯著高于陽性最低值。無母源抗體9只雞攻毒后，從4周起開始檢出病毒血癥，然后比例逐漸增加，在第8周時所有9只雞全部檢出病毒血癥。含母源抗體組雞攻毒后，12只中只有4只雞檢出病毒血癥，最早也在7周后才被檢出，而且病毒血癥都是一過性的，最多持續(xù)4周，而其他8只雞在連續(xù)觀察的14周內(nèi)始終未檢出病毒血癥。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以得出以下結(jié)論:該疫苗能使全部產(chǎn)蛋祖代雞產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，并且