A和B亞群禽白血病病毒gp85基因的表達(dá)及其抗血清的亞群特異性比較.pdf

1、為制備相應(yīng)的特異性抗體用于快速分離鑒定A/B亞群的ALV，本實(shí)驗(yàn)分別克隆表達(dá)了A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)SDAU09C2株的囊膜gp85基因，嘗試應(yīng)用gp85基因的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔來(lái)獲取大量高效價(jià)的特異抗血清。
　　 根據(jù)已發(fā)表A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)SDAU09C2株基因序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)并合成一

2、對(duì)引物。利用PCR方法擴(kuò)增兩毒株的囊膜gp85基因片段，將目的片段克隆至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DH5α)，構(gòu)建重組載體。經(jīng)核酸序列測(cè)定，克隆的基因片段分別長(zhǎng)1017bp，1038bp，為gp85基因開(kāi)放性讀碼框的全長(zhǎng)序列，分別編碼339，346個(gè)氨基酸。將gp85基因片段分別連接至pET-32a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)抗性篩選、PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶分析，篩選獲得目的片段正向插入、有正確讀碼框的陽(yáng)性克隆，分別命名為p

3、ET-SDAU09C1-gp85和pET-SDAU09C2-gp85。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ecoli.BL21(Rosetta)宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確立了最佳的誘導(dǎo)條件為30℃，1mMIPTG濃度，誘導(dǎo)表達(dá)5h。因融合蛋白氨基端含有6個(gè)組氨酸，用鎳金屬親和層析純化目的蛋白。取A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)

4、SDAU09C2株的陽(yáng)性雞血清分別進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白是特異性的。
　　 將純化的融合蛋白按常規(guī)方法免疫家兔，三免后一周，心臟采血分離血清。取兩種抗血清進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)(IFA)測(cè)定效價(jià)，效價(jià)均可達(dá)1:500,其中SDAU09C1抗血清在1:100稀釋時(shí)效果較好，而SDAU09C2抗血清在1:50稀釋時(shí)效果較好。取抗血清最佳稀釋度與本實(shí)驗(yàn)室保存的A亞群禽白血病病毒SDAU09E1株

5、，SDAU09C3株，和J亞群禽白血病病毒HN0001株進(jìn)行IFA區(qū)分鑒定。結(jié)果不論是A亞群SDAU09C1血清還是B亞群SDAU09C2血清都能與A或B亞群的不同毒株發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，但效價(jià)不同。然而，二種血清都不與J亞群的NX0101株發(fā)生反應(yīng)。
　　 用制備的兩種抗血清，采用固定病毒(200TCID50)稀釋血清的方法進(jìn)行交叉中和反應(yīng)。結(jié)果顯示，抗SDAU09C1株gp85產(chǎn)生的兔血清的抗體效價(jià)比較高，對(duì)兩個(gè)分離株都有較高的中